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土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維二糖苷酶(S-C1)活性測(cè)定 試劑盒說明書

閱讀:341      發(fā)布時(shí)間:2023-10-09
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土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維二糖苷酶(S-C1)活性測(cè)定

試劑盒說明書

                                          微量法100/48

 

    意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

C1EC3.2.1.91存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi),是纖維素酶系的組份之一,C1催化多聚糖鏈的末端非還原端釋放出纖維二糖和葡萄糖。

 

測(cè)定原理:

采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定S-C1催化微晶纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

 

需自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀/可見分光光度計(jì)、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體6mL×1瓶,4保存;

試劑二:液體25mL×1瓶,4保存;

 

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:

稱取約0.1g新鮮土樣或風(fēng)干土樣,加入1mL提取液,進(jìn)行冰浴勻漿,室溫振蕩提取30min,然后10000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在EP管中依次加入下列試劑)

試劑名稱(μL

測(cè)定管

對(duì)照管

  樣本

10

10

試劑一

100


蒸餾水


100

混勻,37準(zhǔn)確水浴2h

試劑二

200

200

混勻, 90℃水浴10min(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,測(cè)540nm下吸光值A,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

S-C1活性計(jì)算

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下


標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 6.4078x - 0.0673;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL,y吸光。

單位的定義:每g土樣每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

S-C1活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(W× V÷V樣總) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

10001mg/mL=1000ug/mL;V反總:反應(yīng)體系總體積,0.11mL V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,120 min W:樣本質(zhì)量,g;

 

 b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 3.2039x - 0.0673;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL,y吸光

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

S-C1活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(W× V÷V樣總) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W

10001mg/mL=1000ug/mL;V反總:反應(yīng)體系總體積,0.11mL; V樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,120 min W:樣本質(zhì)量,g。

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