土壤硝酸還原酶(Solid-Nitrate Reductase,S-NR)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/48樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
S-NR催化土壤中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,是土壤硝態(tài)氮還原的關(guān)鍵酶。研究S-NR的活性對(duì)合理施肥,降低氮素的損失具有重要意義。
測(cè)定原理:
S-NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,NO3ˉ +NADH+H+→ NO2ˉ +NAD+ +H 2 O;產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下,與對(duì)–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物;生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰,可用分光光度法測(cè)定。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體12mL×1瓶,-20℃保存。
試劑二:液體8mL×1瓶,-20℃保存。
試劑三:液體9mL×1瓶,4℃保存(如出現(xiàn)結(jié)晶析出,60℃-90℃水浴溶解后使用)。
試劑四:液體9mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1mL,-20℃保存。
0.1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液的配制:用時(shí)將試劑五稀釋100倍,即取 0.1ml 加蒸餾水定容至 10ml。
樣品處理:
新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干,過(guò)30~50目篩。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
試劑名稱(chēng) | 1mL帶蓋離心管 | |||
測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 | |
風(fēng)干土樣(g) | 0.06 | 0.06 | ||
0.1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液(μL) | 60 | |||
蒸餾水(μL) | 225 | 285 | ||
試劑一(μL) | 225 | 225 | ||
試劑二(μL) | 75 | 75 | 75 | 75 |
混勻后,蓋蓋后37℃水浴24h,8000g 25℃離心10min,取上清液
上清液(μL) | 130 | 130 | 130 | 130 |
試劑三(μL) | 85 | 85 | 85 | 85 |
試劑四(μL) | 85 | 85 | 85 | 85 |
混勻,25℃顯色20min,4000g,25℃離心10min,取200uL上清液至微量石英比色皿或96孔板中,540nm下讀取各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測(cè)一次。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
注意點(diǎn):務(wù)必先做2個(gè)樣本的預(yù)測(cè)定,少部分土壤由于樣本特殊性可能出現(xiàn)測(cè)定管小于對(duì)照管,請(qǐng)及時(shí)與我司技術(shù)支持聯(lián)系,以獲得針對(duì)樣本特殊性的調(diào)整測(cè)定方法。
S-NR活性計(jì)算:
單位的定義:每天每g土樣中產(chǎn)生1μmol NO2ˉ的量為一個(gè) S-NR活力單位。
S-NR(μmol /d/g土樣)=C標(biāo)準(zhǔn)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷W÷T =0.5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.1μmol/mL;V反總:反應(yīng)體系總體積,0.3mL;T:反應(yīng)時(shí)間,24h; W:樣本質(zhì)量,0.06g。
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