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土壤亞硝酸還原酶(?Solid-Nitrite reductase,S-NiR)試劑盒說明書

閱讀:317      發(fā)布時(shí)間:2023-10-10
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土壤亞硝酸還原酶(Solid-Nitrite reductaseS-NiR)試劑盒說明書

    微量法100T/48S

 

   :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

土壤亞硝酸還原酶是反硝化作用中的關(guān)鍵酶之一,參與亞硝酸鹽至NO的還原反應(yīng),它的活性反映了生物降解過程中氮素的轉(zhuǎn)化效率,為氮素轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究提供一定的依據(jù)。

 

測(cè)定原理

亞硝酸還原酶可將NO2還原為NO,使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2減少,即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)土壤中亞硝酸還原酶的活性。

 

需自備的儀器和用品

天平、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機(jī)。

 

試劑的組成和配制

試劑一:液體4mL×1瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

試劑三:液體4mL×1瓶,4保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)

試劑四:液體10mL×1瓶,4避光保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解) 

試劑五:液體10mL×1瓶,4避光保存。

工作液:臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。

 

樣品處理

新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干,過30~50目篩。

 

測(cè)定操作表


空白管

對(duì)照管

測(cè)定管

風(fēng)干土樣(g


0.02

0.02

蒸餾水(μL


40


試劑一(μL

40


40

試劑二(μL

40

40

40

混勻后,25℃反應(yīng)1h

試劑三(μL

40

40

40

充分震蕩30S10000rpm4℃,離心10min

上清液(μL

70

70

70

工作液(μL

140

140

140

充分混勻,靜置3min后測(cè)定540nm吸光值,分別記為A空白管、A對(duì)照管、A測(cè)定管。空白管只要做一管,每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

計(jì)算公式

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.5562x+ 0.0088R2 = 0.996x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)。

酶活單位定義:每g土樣每天還原1μmol NO2ˉ 的量為一個(gè)活力單位。

S-NiRμmol /d /g土樣=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷1.5562×V標(biāo)÷W÷T

= 0.617×[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷W

T:反應(yīng)時(shí)間,1h=1/24dV標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.04mLW:樣本質(zhì)量,g

 

b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.7781x+ 0.0088R2 = 0.996x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)。

酶活單位定義:每g土樣每天還原1μmol NO2ˉ 的量為一個(gè)活力單位。

S-NiRμmol /d /g土樣=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷0.7781×V標(biāo)÷W÷T

= 1.234×[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷W

T:反應(yīng)時(shí)間,1h=1/24dV標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.04mL W:樣本質(zhì)量,g

 

注意事項(xiàng)

1.        配制好的工作液3天內(nèi)使用完。

2.        若吸光值超過1.5,將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3.        嚴(yán)格控制顯色時(shí)間,否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。

4.        標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL

5.        A空白管-A測(cè)定管-A對(duì)照管)線性范圍為0.02-1.5      

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