土壤植酸酶(phytase)試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
植酸酶(phytase)是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)的一類酶的總稱,屬磷酸單酯水解酶,它能將食品和飼料中植酸及其鹽轉化為可供有機體利用的有效磷,降低糞便中的磷含量,減輕對環境的污染,改善營養成分的吸收和利用,因此具有極其廣泛的研究和應用價值。
測定原理:
植酸酶在一定溫度和pH值條件下,水解底物植酸鈉生成無機磷與肌醇衍生物,無機磷在酸性環境中與鉬酸銨顯色劑反應生成藍色復合物,在700nm處有特征吸收峰,根據700nm處吸光值變化可計算得植酸酶活性。
自備實驗用品及儀器:
天平、低溫離心機、酶標儀、96孔板、恒溫水浴鍋,甲苯(不允許快遞)。
試劑的組成和配制:
緩沖液:液體60mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:粉劑×1瓶,4℃避光保存,臨用前加緩沖液30mL配制,現用現配;用不完的試劑4℃保存一個月。
試劑二:液體15mL×1瓶,4℃保存。
顯色劑:粉劑×6管,4℃避光保存,臨用前根據用量每瓶加0.4mL雙蒸水溶解,再加1.6mL試劑二混勻。
樣本處理:
新鮮土樣自然風干或37度烘箱風干,過30~50目篩。
測定操作表:
對照管 | 測定管 | |
樣本(g) | 0.03 | 0.03 |
甲苯 | 20 | 20 |
振蕩混勻,室溫放置15min | ||
緩沖液(µL) | 500 | |
試劑一(µL) | 500 | |
混勻,37℃孵育24h,10000g,4℃離心5min,取上清 | ||
上清 | 100 | 100 |
顯色劑(µL) | 100 | 100 |
混勻,靜置15min,測定700nm處吸光值,△A=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。 |
酶活性計算公式:
標準曲線:y = 0.8795x + 0.0084,R2 = 0.9977;x為標準品濃度(μmol/mL),y為吸光值△A。
酶活性定義:在37℃,pH5.5的條件下,每克土樣每小時從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無機磷為一個酶活力單位。
植酸酶活性(μmol/h /g 土樣)=(△A-0.0084)÷0.8795×V反總÷W÷T
=0.82×(△A-0.0084)
V反總:反應總體積,0.52mL;T:反應時間,24h;W:樣本質量,0.03g。
注意事項:
1、顯色劑需要臨用前根據用量配制,每一瓶是10個樣本的用量,新配制的顯色劑若有顏色則已經污染或者試劑過期,應放棄使用。
2、ΔA線性范圍為0.01-0.5。
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