γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100T/96S
注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
GCL 是 GSH 合成的限速酶,GSH 對(duì) GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié),如氧化劑、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子和炎癥因子等。GCL活性高低對(duì)GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
測(cè)定原理:
在ATP和Mg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同時(shí)ATP去磷酸化產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷分子,通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷增加速率,即可計(jì)算出GCL活性。
自備儀器和用品:
冷凍離心機(jī)、水浴鍋、移液器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體105mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。
試劑四:液體7mL×1瓶,室溫保存。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水,充分震蕩溶解后,緩緩加入400µL濃硫酸(自備),邊加邊攪拌。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體:直接測(cè)定。
GCL測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管:取1.5mLEp管,依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和蒸餾水24µL,混勻后蓋緊,37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min;再加入試劑四60µL,混勻后,室溫(25℃左右)8000g,離心10 min,取上清100µL,加入試劑五100µL,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測(cè)定660nm處光吸收,記為A空白管。
3. 測(cè)定管:取1.5mLEp管,依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和上清液24µL,混勻后蓋緊,37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min;再加入試劑四60µL,混勻后,室溫(25℃左右)8000g,離心10 min,
4. 取上清100µL,加入試劑五100µL,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測(cè)定660nm處光吸收,記為A測(cè)定管。
注意:空白管只需要測(cè)定一次。
GCL活性計(jì)算公式:
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.1427x,R2=0.9987
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃下,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。
GCL(μg/min /mg prot)=[(A測(cè)定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=3.815×(A測(cè)定管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃下,每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為為1個(gè)酶活單位。
GCL(μg/min /g 鮮重)= [(A測(cè)定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×(A測(cè)定管-A空白管)÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:37℃下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。
GCL(μg/min /104 cell)=[(A測(cè)定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×(A測(cè)定管-A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按照液體體積計(jì)算
活性單位定義:37℃下,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。
GCL(μg/min /mL)= [(A測(cè)定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T
= 3.815×(A測(cè)定管-A空白管)
0.1427:回歸方程系數(shù);V反總:反應(yīng)總體積(mL)196 µL=0.196 mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,24µL =2.4×10-2 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間:15min。
b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.07135x,R2=0.9987
((1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃下,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。
GCL(μg/min /mg prot)= [(A測(cè)定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=7.63×(A測(cè)定管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃下,每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為為1個(gè)酶活單位。
GCL(μg/min /g 鮮重)= [(A測(cè)定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 7.63×(A測(cè)定管-A空白管)÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:37℃下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。
GCL(μg/min /104 cell)=[(A測(cè)定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 7.63×(A測(cè)定管-A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按照液體體積計(jì)算
活性單位定義:37℃下,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。
GCL(μg/min /mL)= [(A測(cè)定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷V樣÷T
=7.63×(A測(cè)定管-A空白管)
0.07135:回歸方程系數(shù);V反總:反應(yīng)總體積(mL)196 µL=0.196 mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,24µL =2.4×10-2 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間:15min。
注意事項(xiàng):
(1)樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力,以免影響其活力。如果是勻漿液,避免反復(fù)凍融。
(2)所有試劑配制完后,除表明4℃保存外,請(qǐng)于1天內(nèi)用完。
(3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程請(qǐng)帶手套,試劑三中有強(qiáng)腐蝕性物質(zhì),注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。
(4)測(cè)定吸光值時(shí)請(qǐng)于水浴后10~40分鐘內(nèi)測(cè)完。
(5)樣本測(cè)定前先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),如吸光值太高,應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù),使得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),哺乳動(dòng)物組織和血液一般稀釋3~5倍。
(6)試劑三配制過(guò)程中,可能會(huì)產(chǎn)生黑色固體,其不影響結(jié)果,注意吸取時(shí)不要將黑色固體吸入。
(7)細(xì)胞中GCL活性測(cè)定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間,細(xì)胞中GCL的提取時(shí)可加試劑一(或生理鹽水)后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞
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