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谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒說明書

閱讀:357      發布時間:2023-10-13
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谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原循環中催化還原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應,生成氧化型谷胱甘肽GSSG,從而保護生物膜免受ROS的損害,維持細胞的正常功能;而且具有保護肝臟、提高機體免疫力、拮抗有害金屬離子對機體的傷害和增加機體抗輻射等能力。

 

測定原理:

GSH-Px催化有機過氧化物氧化GSH,產生GSSG;谷胱甘肽還原酶(GR)催化NADPH還原GSSG,再生GSH,同時NADPH氧化生成NADP+NADPH340 nm有特征吸收峰,而NADP+沒有;通過測定340 nm光吸收減少速率來計算GSH-Px活性。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、酶標儀、96孔板、和蒸餾水。

 

試劑組成和配置:

試劑一:液體120mL×1瓶,室溫保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體10μL×1支,-20℃保存。

試劑四:液體200μL×1瓶,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體:直接測定。

GSH-Px測定操作:

1. 酶標儀預熱30 min,調節波長到340 nm

2. 混合試劑在25℃或者37℃(哺乳動物)水浴中預熱30min

3. 混合試劑配制:臨用前,在試劑二中加入試劑一20 mL,充分震蕩溶解后加入全部試劑三,混勻。(當天用完)

4. 試劑四的稀釋:吸取21.5μL試劑四,加入5mL蒸餾水充分混勻,臨用前配制,配制好的試劑當天使用。

5. 測定管:依次在96孔板中加入20μL上清液、160μL預熱的混合試劑、20μL稀釋后的試劑四,迅速混勻后于340nm處測定第30 s和第210s的吸光值,分別記為A1A2△A測定管= A1A2

 

 

GSH-Px活性計算:

使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

GSH-Px活力單位定義:一定溫度中,每mg蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A÷ε÷d×V反總×109Cpr×V樣)÷T

=1072×△A÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

GSH-Px活力單位定義:一定溫度中,每g樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/g 鮮重)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷(W×V÷V樣總)÷T

=1072×△A÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:一定溫度中,每104個細胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [△A÷ε÷d×V反總×109]÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

=1072×△A÷細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:一定溫度中,每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷V÷T

=1072×△A

εNADPH摩爾消光系數6.22×103L/mol/cmd96孔板光徑,0.5 cmV反總:反應體系總體積,200μL=2×10-4 L1061 mol=1×106μmol Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積,20μL =2×10-2 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間,3 min

 

注意事項:

1)樣品處理等過程均需要在冰上進行,且須在當日測定酶活力;

2)混合試劑和底物液須臨用前配制,配完后置于冰上,當天使用完;

3)測定過程操作須迅速;

4)細胞中GSH-Px活性測定時,細胞數目須在300-500萬之間,細胞中GSH-Px的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞。

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優利科(上海)生命科學有限公司

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