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氧化型谷胱甘肽含量測定試劑盒說明書

閱讀:323      發布時間:2023-10-16
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氧化型谷胱甘肽含量測定試劑盒說明書

                                              微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

GSH/GSSG是細胞內最重要的氧化還原對之一。因此,測定細胞內GSHGSSG含量以及GSH/GSSG比值,能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態,也是谷胱甘肽氧化還原循環的主要指標之一。

 

測定原理:

利用2-VP法測GSSG含量。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

 

試劑組成和配置:

試劑一:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑二:液體600μL×1支,4保存。

試劑三:液體50mL×1瓶,4保存。

試劑四:液體2.5mL×1瓶,4保存。

試劑五: 液體15μL×1瓶,-20保存。臨用前加入0.3mL試劑三稀釋,4保存。

試劑六:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入20 mL試劑三溶解,現配現用。

 

粗酶液提?。?/span>

1. 組織:按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)待測。

2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);8000g 4離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)混勻待測。

3. 血清等液體:直接測定。

 

GSSG含量測定:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到412nm,蒸餾水調零。

2. 試劑三置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中保溫30min。

3.1 mL EP管,加入100μ L上清液,5 μ L試劑二,蓋緊后混勻,得混合液,置于37水浴30min;取21μ L混合液于96孔板,然后依次加入20 μ L試劑四、2 μ L試劑五和140 μ L試劑六,迅速混勻后,測定30 s150 s光吸收A1A2,計算ΔA=A2-A1。

 

GSSG含量計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)

 

2、 按蛋白濃度計算

GSSGnmol/mg prot=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V÷(V×Cpr)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

GSSGnmol /g 鮮重=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V÷(V÷V樣總×W)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷W

4、按細胞數量計算

GSSGnmol/104 cell=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V÷(V÷V樣總×細胞數量)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷細胞數量

5、按照液體體積計算

GSSGnmol/mL=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V÷V

=36.23×(ΔA+0.0011)

V樣:反應中加入樣本體積,20μL;V樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質量,gCpr樣本蛋白濃度(mg/mL

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為y=0.0138x-0.0011;x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)

2、 按蛋白濃度計算

GSSGnmol/mg prot=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V÷(V×Cpr)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

GSSGnmol /g 鮮重=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V÷(V÷V樣總×W)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷W

4、按細胞數量計算

GSSGnmol/104 cell=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V÷(V÷V樣總×細胞數量)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷細胞數量

5、按照液體體積計算

GSSGnmol/mL=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V÷V

=72.46×(ΔA+0.0011)

V樣:反應中加入樣本體積,20μLV樣總:加入提取液體積, 1mLW:樣品質量,gCpr樣本蛋白濃度(mg/mL

 

注意事項:

1.        提取過程中去掉蛋白質,所以提取液不能用于測定蛋白含量。

2.        臨用前配制的試劑配好后4℃保存,2天內使用完畢。

3.        Z低檢出限為0.1μmol/L。

4.  反應溫度嚴格來說,為保證重復性,應在25℃下進行反應。

5.   反應時間需精確控制,否則會影響反應速率計算,產生較大誤差。

6.   樣品中的GSSG濃度盡可能低一些,否則反應速率太大,沒法控制,所以稀釋倍數要盡量大些。

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優利科(上海)生命科學有限公司

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