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硫氧還蛋白過氧化物酶(TPX)活性測定試劑盒說明書

閱讀:314      發布時間:2023-10-16
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硫氧還蛋白過氧化物酶TPX活性測定試劑盒說明書

                                                 微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

TPX屬于過氧化物酶家族,在體內主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現抗氧化作用,功能與GPX類似,也是谷胱甘肽氧化還原循環關鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內,如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細菌和古細菌,在進化上高度保守。TPX與細胞增殖、分化、細胞凋亡及腫瘤發生調控密切相關。TPX的主要功能包括細胞脫毒、抗氧化和調節由過氧化氫介導的信號轉導和免疫反應。

 

測定原理:

TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇(DTT),H2O2的吸收波長為240nm,通過測定240nm吸光度的下降速率,即可計算出TPX活性。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體120mL×1瓶,室溫保存。

試劑二:液體20mL×1瓶,- 20℃保存。

試劑三:液體2mL×1支,4℃

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體:直接測定。

 

TPX測定操作:

取微量石英比色皿或96孔板,加入4 μL上清液,180 μL試劑二,16 μL試劑三,迅速混勻后于240 nm測定10s130s吸光度,記為A1A2

 

TPX活性計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。

TPXnmol/min /mg prot=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷Cpr×V樣)÷T

 

=573×(A1A2)÷Cpr

 (2). 按樣本質量計算

活性單位定義:25或者37中,每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。

TPX活性(nmol/min/g 鮮重=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=573×(A1A2)÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:25或者37中,每104個細胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。

TPX活性(nmol/min/104 cell=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

=573×(A1A2)÷細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:25或者37中,每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。

TPX活性(nmol/min /mL=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷V÷T

=573×(A1A2)

εH2O2的摩爾消光系數,43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cmd:比色皿光徑,1cmV反總:反應體系總體積(L),200 μ L=2×10-4 LCpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL);W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),4 μL=4×10-3 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間(min),2min

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。

TPX活性(nmol/min /mg prot=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷Cpr×V樣)÷T

=1146×(A1A2)÷Cpr

 (2). 按樣本質量計算

活性單位定義:25或者37中,每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。

TPX活性(nmol/min/g 鮮重=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=1146×(A1A2)÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:25或者37中,每104個細胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。

TPX活性(nmol/min/104 cell=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

=1146×(A1A2)÷細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:25或者37中,每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。

TPX活性(nmol/min /mL=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷V÷T

=1146×(A1A2)

εH2O2的摩爾消光系數,43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cmd96孔板光徑,0.5cmV反總:反應體系總體積(L),200 μL=2×10-4 LCpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL);W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),4 μ L=4×10-3 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間(min),2min

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