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單胺氧化酶(Monoamine Oxidase,MAO)試劑盒使用方法

閱讀:402      發(fā)布時(shí)間:2023-10-19
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單胺氧化酶(Monoamine Oxidase,MAO)試劑盒說明書

                                                      微量法100T/96S

 

 

注    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎動(dòng)物的各種器官,特別是分泌腺、腦、肝臟,在無(wú)脊椎動(dòng)物、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質(zhì)代謝,含量較低,具有重要的生理功能,其活性能反映肝纖維化的程度。此外,MAO活性異常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)出現(xiàn)紊亂,從而引發(fā)多種病癥。

 

測(cè)定原理:

MAO催化單胺類底物脫氨生成相應(yīng)的醛,進(jìn)一步氧化成酸;底物在360nm處有特征吸收峰,測(cè)定360nm光吸收下降的速率,計(jì)算MAO活性。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體2mL×1管,4℃避光保存。

 

粗酶液提取:

1.        稱取約0.1g樣品,加1 mL預(yù)冷的提取液一充分冰浴勻漿,1000g,4℃,離心10min,棄沉淀;把上清轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的離心管,10000g,4℃,離心30min,棄上清;加入1mL預(yù)冷的提取液二,震蕩混勻,16000g,4℃,離心40min,棄上清;沉淀加入預(yù)冷的1mL 試劑一,震蕩混勻,即粗酶液(可用于可溶性蛋白濃度測(cè)定)。

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后10000g,4℃,離心10min,棄沉淀;把上清轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的離心管,10000g,4℃,離心30min,棄上清;加入1.0 mL預(yù)冷的提取液二,震蕩混勻,16000g,4℃,離心40min,棄上清;沉淀加入預(yù)冷的1.0 mL 試劑一,震蕩混勻,即粗酶液(可用于可溶性蛋白濃度測(cè)定),取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清:直接測(cè)定。

 

測(cè)定操作表:

1、   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至360nm。

2、   操作表


對(duì)照管

測(cè)定管

酶液(µL)


20

試劑一(µL)

180

160

試劑二(µL)

20

20

混勻,于微量石英比色皿/96孔板,對(duì)照管調(diào)零,測(cè)定360nm處吸光值A(chǔ)1,然后37℃水浴60min,對(duì)照管調(diào)零,測(cè)定360nm處吸光值A(chǔ)2。ΔA=A1-A2

 

注意:空白管只需測(cè)定一次。

 

MAO活性計(jì)算公式:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白含量計(jì)算

酶活定義:37℃,pH7.6時(shí),每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性(nmol/min / mg prot)= ×V反總÷(V樣× Cpr)÷T= 114×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算:

酶活定義:37℃,pH7.6時(shí),每克樣品1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性(nmol/min / g 鮮重)=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T = 114×ΔA÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義:37℃,pH7.6時(shí),每104個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性(nmol/min / 104 cell)= ×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T

= 114×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計(jì)算

酶活定義:37℃,pH7.6時(shí),每升血清1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性(nmol/min /L)=×V反總÷V樣=114×ΔA

ε:底物摩爾消光系數(shù),1460L /mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;T:反應(yīng)時(shí)間,60min,W:樣本質(zhì)量,g

 

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白含量計(jì)算

酶活定義:37℃,pH7.6時(shí),每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性(nmol/min / mg prot)= ×V反總÷(V樣× Cpr)÷T= 228×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算:

酶活定義:37℃,pH7.6時(shí),每克樣品1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性(nmol/min / g 鮮重)=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T = 228×ΔA÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義:37℃,pH7.6時(shí),每104個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

 

 

DAO活性(nmol/min / 104 cell)= ×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T

= 228×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、   按照液體體積計(jì)算

酶活定義:37℃,pH7.6時(shí),每升血清1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性(nmol/min /L)=×V反總÷V樣=228000×ΔA

ε:底物摩爾消光系數(shù),1460L /mol /cm; d:96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;T:反應(yīng)時(shí)間,60min,W:樣本質(zhì)量,g

 

注意事項(xiàng):

1、吸光度變化應(yīng)該控制在0.01~0.8之間。否則加大樣品量或稀釋樣品,注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。

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