高鐵還原酶(ferric-chelate reductase, FCR)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/96樣
注 意: 正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
高鐵還原酶(ferric-chelate reductase, FCR)催化高價(jià)鐵螯合物中的Fe3+還原為Fe2+,在部分物種鐵元素的吸收中有重要作用。
測(cè)定原理:
FCR催化Fe3+還原為Fe2+,Fe2+和ferrozine反應(yīng)顯色,在562nm下有特征吸光值。
自備用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體6mL×1瓶,4℃避光保存;
試劑二:液體6mL×1瓶,4℃避光保存;
試劑三:液體6mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
按照組織質(zhì)量(g):水(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至562nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液配制:將試劑一、二、三以1:1:1的比例混合。臨用前配制,用多少配多少。
3、 在微量石英比色皿/96孔板中,加入50μL樣本上清和150μL工作液,混勻,記錄初始吸光值A1和30min后的吸光值A2。ΔA=A2-A1。
FCR活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 8.0014x + 0.0011,R2 = 0.9997;
(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義:每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmolFe2+-ferrozine定義為一個(gè)酶活力單位。
FCR(nmol/min/g 鮮重)=(△A-0.0011)÷ 8.0014×1000×V標(biāo)÷(V樣÷V樣總×W)÷T
= 4.166×(△A-0.0011)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolFe2+-ferrozine定義為一個(gè)酶活力單位。
FCR(nmol/min/mg prot)=(△A-0.0011)÷8.0014×1000×V標(biāo)÷(V樣÷V樣總×Cpr)÷T
=4.166×(△A-0.0011)÷Cpr
V樣總:加入提取液體積,1 mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,50μL;V標(biāo):加入標(biāo)準(zhǔn)品體積 ,50μL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;1000,μmol到nmol的轉(zhuǎn)換系數(shù)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 4.0007x + 0.0011,R2 = 0.9997;y,吸光度
(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義:每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmolFe2+-ferrozine定義為一個(gè)酶活力單位。
FCR(nmol/min/g 鮮重)=(△A-0.0011)÷4.0007×1000×V標(biāo)÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=8.331×(△A-0.0011)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolFe2+-ferrozine定義為一個(gè)酶活力單位。
FCR(nmol/min/mg prot)=(△A-0.0011)÷4.0007×1000×V標(biāo)÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=8.331×(△A-0.0011)÷Cpr
V樣總:加入提取液體積,1 mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,50μL;V標(biāo):加入標(biāo)準(zhǔn)品體積 ,50μL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;1000,μmol到nmol的轉(zhuǎn)換系數(shù)。
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