錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
錳過氧化物酶（EC1.11.1.13）是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶，主要存在于擔(dān)子菌中，屬于木質(zhì)素降解酶系，能有效的降解木質(zhì)素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物，疊氮化合物、DTT，多環(huán)芳烴等。
測定原理：
錳過氧化物酶在Mn2+存在的條件下，將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，在465nm有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制：
試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體2mL×1支，4℃保存。
試劑三：液體5mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體2mL×1支，4℃保存。
酶液提取：
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。
測定操作：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至465nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 測定前將試劑一、二、三、四在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）放置10min以上。
3、 樣本測定表
試劑名稱（µL） | 測定管 |
樣本 | 20 |
試劑一 | 100 |
試劑二 | 20 |
試劑三 | 40 |
試劑四 | 20 |
在微量石英比色皿或96孔板中按順序加入上述試劑，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄465nm下30s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和2min30s后的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。
注意：若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三、四按比例配成混合液，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）放置10min以上，測定時(shí)加入20µL樣本和180µL混合液測定。
酶活計(jì)算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 413×ΔA÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T
= 413×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T= 413×ΔA
ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，2×10-4 L；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min
b. 用96孔板測定的計(jì)算公式如下
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=826×ΔA÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 826×ΔA÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T
= 826×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T= 826×ΔA
ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，2×10-4 L；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min
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