木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.14）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，屬于木質(zhì)素降解酶系，在木質(zhì)素生物降解、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、芳香化合物轉(zhuǎn)化與降解及環(huán)境污染控制等方面具有較大的應(yīng)用潛力。
測(cè)定原理：
木質(zhì)素過(guò)氧化物酶催化天青脫甲基，在651nm處測(cè)定吸光值減少。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、可調(diào)式移液器、冰。
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入115mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存一個(gè)月。
試劑二：液體5mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體5mL×1支，4℃保存。
酶液提取：
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。
測(cè)定操作：
1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至651nm。
2、臨用前按每個(gè)樣本試劑一：試劑二：試劑三=80:40:40（μL）的比例配制工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
3、在96孔板中依次加入如下試劑
測(cè)定管 | |
樣品（μL） | 40 |
工作液（μL） | 160 |
充分混勻，立即測(cè)定651nm處10s和130s吸光值，記為A1和A2，△A=A1- A2 | |
酶活計(jì)算公式：
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A651變化0.01為一個(gè)酶活力單位。
LiP活性（U/mg prot）= ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =250×ΔA÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A651變化0.01為一個(gè)酶活力單位。
LiP活性（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =250×ΔA÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A651變化0.01為一個(gè)酶活力單位。
LiP活性（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=0.5×ΔA
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A651變化0.01為一個(gè)酶活力單位。
LiP活性（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =250×ΔA
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min
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