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肉桂醇脫氫酶( Cinnamyl-alcohol dehydrogenase,CAD)試劑盒說明書

閱讀:312      發(fā)布時間:2023-10-20
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肉桂醇脫氫酶( Cinnamyl-alcohol dehydrogenase,CAD)試劑盒說明書

                                     微量法100管/96樣


 

注   意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

CAD是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一,是木質(zhì)素單體合成反應(yīng)中的最后一步,催化多種不同的肉桂醛(香豆醛、芥子醛以及松柏醛等)生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于高等植物、酵母、菌類中,研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理,為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測定原理:

CAD催化肉桂醇和NADP生成肉桂醛和NADPH,在340nm下測定NADPH生成速率,即可反映CAD活性。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體25 mL×1瓶, 4℃保存;

試劑二:粉劑×2瓶,-20℃保存;

粗酶液提?。?/p>

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

(1)在試劑二中加入10mL試劑一充分溶解混勻,室溫使用渦旋振蕩儀振蕩溶解15min,如未溶解可適當(dāng)延長振蕩時間;置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;現(xiàn)配現(xiàn)用(配好后24h內(nèi)用完);

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二,混勻,立即記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和 5min后的吸光值A(chǔ)2,計算ΔA=A2-A1。

 

 

CAD活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

CAD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

 

(2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

CAD(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

CAD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

b.用96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

CAD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

CAD(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

CAD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

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