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亞鐵氧化酶(Hephaestin,HP)試劑盒說明書

閱讀:304      發(fā)布時(shí)間:2023-10-23
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亞鐵氧化酶(Hephaestin,HP)試劑盒說明書

                                        微量法100/48

 

   正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

Hephaestin (HP)作為銅藍(lán)蛋白的同系物,是近年來發(fā)現(xiàn)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞鐵氧化酶,HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內(nèi)鐵代謝。HP的表達(dá)可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調(diào)節(jié)。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+,在介導(dǎo)鐵的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中有重要作用。

 

測(cè)定原理

HP催化Fe2+氧化為Fe3+Fe2+ferrozine反應(yīng)顯色,在560 nm下有特征吸光值。通過測(cè)定Fe2+的減少速率可測(cè)得亞鐵氧化酶的活性。

 

自備用品:

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體60 mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:液體1.5 mL×1瓶,4℃保存;

試劑三:液體11 mL×1瓶,4℃避光保存。

 

粗酶液提取:

按照組織質(zhì)量(g):水(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560 nm

2. 96孔板中加入下列試劑

試劑名稱(μL

測(cè)定管

對(duì)照管

試劑一

50

50

試劑二

10

10

樣本

10

10

蒸餾水

30

30

試劑三

混勻,40℃靜置30 min

100

試劑三

100


混勻,立即測(cè)定A對(duì)照和A測(cè)定,ΔA=A對(duì)照-A測(cè)定。(每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管)

 

HP活性計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 8.2135x - 0.0006R2 = 0.9998(x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,μmol/mLy為吸光值ΔA)

 

1)按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義:每g樣本每分鐘氧化1nmol Fe2+定義為一個(gè)酶活力單位。

HPnmol/min/g 鮮重)=△A+0.0006÷ 8.2135×V÷T ÷(W× V÷V樣總)× 1000

                       = 40.58×△A+0.0006÷W

2)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg蛋白每分鐘氧化1nmol Fe2+定義為一個(gè)酶活力單位。

HPnmol/min/mg prot=△A+0.0006÷ 8.2135×V÷T ÷Cpr×V樣)

                       = 40.58×△A+0.0006÷Cpr

V總:反應(yīng)體系體積,0.1 mLV樣:加入樣本體積0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,30minW:樣品質(zhì)量,gCpr:樣本蛋白濃度,mg/mL1000μmolnmol的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

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