檸檬酸(citric acid, CA)含量測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
CA是生物體內常見的有機酸,是重要的食品風味物質。此外,CA是三羧酸循環第一步反應的產物。
測定原理:
酸性條件下,檸檬酸還原Cr6+生成Cr3+,在545nm處有特征吸收峰;通過測定545nm吸光值的增加,即可計算出樣品中檸檬酸含量。
自備儀器和用品:
低溫離心機、水浴鍋、可調式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配置:
試劑一:液體×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體×1管,-20℃保存。
試劑四:粉劑×1管,室溫保存。臨用前配制,加入2mL試劑一,充分溶解。
試劑五:液體×1管,4℃避光保存。
標準品:液體×1管,250μmol/L檸檬酸標準液,4℃保存。
樣品中檸檬酸提取:
1. 液體樣品中檸檬酸提取:取0.1mL液體加試劑一0.9mL,充分混勻,11000g, 4℃離心10min,取上清液,待測。
2. 組織中檸檬酸提取:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。11000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
3. 線粒體中檸檬酸提取:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿,600g/min,4℃離心5min;取上清至另一EP管中,11000g,4℃離心10min,棄上清(此上清液可用于細胞質CA含量測定);向沉淀中加試劑二200μl,以及試劑三2μl,充分懸浮溶解,11000g,4℃離心10min,取上清液,待測。
4. 細菌、真菌中:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);11000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
測定操作:
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到545 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑一置于30℃水浴中預熱30min。
3. 空白管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL蒸餾水,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A空白管。
4. 標準管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL標準液,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A標準管。
5. 測定管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL上清液,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,充分混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A測定管。
注意:空白管和標準管只需測定一次。
計算公式:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1. 按液體樣品的體積計算
檸檬酸含量(nmol/L)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×樣品稀釋倍數×V總
= 2500×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)
C標準液:250μmol/L=0.25 m mol/L;樣品稀釋倍數:(0.1 mL樣品+0.9mL試劑一)÷ 0.1 mL樣品=10;V總:1mL。
2. 按組織質量計算
檸檬酸含量(nmol/g 鮮重)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V總÷W
= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W
C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;W:樣品質量,g。
3. 按蛋白含量計算
檸檬酸含量(nmol/mg prot)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]÷Cpr
= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr
C標準液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白質含量,mg/mL。
4. 按細胞數量計算
檸檬酸含量(nmol/104 cell)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V總÷細胞數量
= 250×(A測定管-A空白管) ÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數量
C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;
b.使用96孔板測定的計算公式如下
3. 按液體樣品的體積計算
檸檬酸含量(nmol/L)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×樣品稀釋倍數×V總
= 2500×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)
C標準液:250μmol/L=0.25 m mol/L;樣品稀釋倍數:(0.1 mL樣品+0.9mL試劑一)÷ 0.1 mL樣品=10;V總:1mL。
4. 按組織質量計算
檸檬酸含量(nmol/g 鮮重)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V總÷W
= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W
C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;W:樣品質量,g。
5. 按蛋白含量計算
檸檬酸含量(nmol/mg prot)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]÷Cpr
= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr
C標準液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白質含量,mg/mL。
6. 按細胞數量計算
檸檬酸含量(nmol/104 cell)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V總÷細胞數量
= 250×(A測定管-A空白管) ÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數量
C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;
注意事項:
1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行。
2. 試劑四需現配現用,配置好的一周內使用完;
3. 試劑五為易致癌物質,實驗過程中,需佩戴手套,避免試劑五濺到皮膚上。
4. 檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測定,如需測定蛋白含量,需另取組織,使用本公司BCA試劑盒進行測定。
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