3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關鍵酶，與糖異生途徑、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關，在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。
測定原理：
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、無機磷和NAD，340nm處測定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低。
需自備的儀器和用品
分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；
試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑三：液體14uL×1支，4℃保存；
組織樣本的前處理：
①總GAPDH酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定。
②胞漿和葉綠體GAPDH酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿GAPDH酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中GAPDH酶活性。
建議測定總GAPDH酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照
步驟②提取粗酶液。
細菌或培養(yǎng)細胞的前處理：
先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
（2）在試劑三中加入500μL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本、5μL試劑三和190μL工作液，混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，記錄340nm處20s時的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。
GAPDH活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T=2.572×ΔA
V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=2572×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T=5.144×ΔA
V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
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