己糖激酶(hexokinase,HK)試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
HK(EC 2.7.1.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,是葡萄糖分解過程中的第一個關鍵酶,催化葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點。
測定原理:
HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH,NADPH在340nm有特征吸收峰。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
2、 樣本測定
(1)在試劑二中加入18mL試劑一充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
(2)在試劑三中加入1mL試劑一,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二,混勻,立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
注意:不同勻漿組織中HK活力不一樣,做正式試驗之前請做1-2只預試,若ΔA>0.5,則說明組織活力太
高,必須用提取液稀釋成適當濃度勻漿上清液(計算公式中乘以相應稀釋倍數),或縮短反應時間至2min,使ΔA<0.5,以提高檢測靈敏度。
HK活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)HK活性
單位的定義:每毫升血清(漿)在每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
HK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=643×ΔA
2、組織、細菌或細胞中HK活性
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
HK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
HK(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
HK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)HK活性
單位的定義:每毫升血清(漿)在每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
HK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1286×ΔA
2、組織、細菌或細胞中HK活性
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
HK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
HK(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
HK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
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