磷酸丙糖異構酶（Triose-phosphate isomerase，TPI）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
植物葉綠體中磷酸丙糖異構酶是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉化，磷酸二羥丙酮能快速透過葉綠體的包膜進入細胞質，并在其中逐步轉化為蔗糖。
測定原理：
磷酸丙糖異構酶將磷酸二羥丙酮轉化為3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛與NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構酶的活性的高低。
自備實驗用品及儀器：
天平、低溫離心機、研缽、震蕩儀、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板。
試劑組成和配制：
提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體12mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
酶液提取：
①總TPI酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定。
②胞漿和葉綠體TPI酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿TPI酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中TPI酶活性。
建議測定總TPI酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的TPI，則按照步驟②提取粗酶液。
測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。
2. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入120μL試劑一，20μL試劑二，20μL試劑三，20μL試劑四，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A2-A1
計算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按照樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
酶活單位定義：每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
TPI（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W
V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g
b. 用96孔板測定的計算公式如下
（1）按照樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
酶活單位定義：每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
TPI（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W
V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g
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