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丙酮酸含量測定試劑盒說明書

閱讀:358      發(fā)布時間:2023-10-25
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丙酮酸(pyruvic acid PA含量測定試劑盒說明書

                                          微量法100/96

 

    意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

丙酮酸通過乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝,起著重要的樞紐作用。

 

測定原理:

丙酮酸與2,4-er硝ji苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-er硝基苯腙,在堿性溶液中呈顯色。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體2.5mL×1瓶, 4保存;

試劑二:液體12.5mL×1瓶, 4保存。

 

丙酮酸提取:

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次),靜置30min 8000g25℃離心10min,取上清待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿,靜置30min8000g25℃離心10min,取上清待測。

3、血清(漿)樣品按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)15~10的比例(建議0.1mL血清(漿)加入1mL提取液),進行冰浴勻漿,靜置30min 8000g25℃離心10min,取上清待測。

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至520nm,蒸餾水調(diào)零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入75μL樣本25μL試劑一,混勻,靜置2min,加入125μL試劑二,混勻,于520nm波長處測定管吸光值A

 

丙酮酸含量計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 0.0466x + 0.0675 x為丙酮酸含量(µg/mL),y為吸光值。

2、按照血清(漿)體積計算

丙酮酸含量(μg/mL= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷V3×V1÷V2=214.6×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計算

丙酮酸含量(μg/mg prot=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計算

丙酮酸含量(µg/g鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2=21.46×(A-0.0675) ÷W

 

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷500×V1÷V2=0.043×(A-0.0675)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075mLV2:加入提取液體積,1 mLV3:加入血清(漿)體積,0.1 mL Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

b. 96孔板測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 0.0233x + 0.0675 x為丙酮酸含量(µg/mL),y為吸光值。

2、按照血清(漿)體積計算

丙酮酸含量(μg/mL= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷V3×V1÷V2=429.2×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計算

丙酮酸含量(μg/mg prot=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計算

丙酮酸含量(µg/g鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2=42.92×(A-0.0675) ÷W

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷500×V1÷V2=0.086×(A-0.0675)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075mLV2:加入提取液體積,1 mLV3:加入血清(漿)體積,0.1 mL Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

注意:Z低檢測限為1μg/mL1μg/g鮮重或10ng/mg prot

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