丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
PK(EC 2.7.1.40)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,催化糖酵解過程中的最后一步反應,是糖酵解過程中的主要限速酶之一,也是產生ATP的關鍵酶之一,因此測定PK活性具有重要意義。
測定原理:
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸,乳酸脫氫酶進一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映PK活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;;
試劑二:粉劑×2瓶,-20℃保存;
試劑三:液體10μL×2支,4℃保存;
樣本的前處理:
1、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至340nm,蒸餾水調零。
2、 樣本測定
(1)試劑二的配制:臨用前取試劑二一瓶,加入9mL試劑一和1.06mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;現(xiàn)配現(xiàn)用。
(2)試劑三的配制:臨用前取試劑三一支,加入0.6mL蒸餾水充分溶解待用;現(xiàn)配現(xiàn)用。
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二,混勻,立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
PK活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)中PK活力的計算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1608×ΔA
2、組織、細菌或細胞中PK活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)中PK活力的計算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK(nmol/min /mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3216×ΔA
2、組織、細菌或細胞中PK活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。
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