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3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK) 試劑盒說明書

閱讀:324      發布時間:2023-10-25
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3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinasePGK

試劑盒說明書

                                                    微量法100T/96S


    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關鍵酶,廣泛存在于動植物和微生物體內,催化13-二磷酸甘油酸轉變為3-磷酸甘油酸,產生1分子ATP,具有影響DNA復制和修補及刺激病毒RNA合成等生物學功能,廣泛應用于藥物靶標設計。

 

測定原理:

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP產生1,3-二磷酸甘油酸和ADP1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH作用下產生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸,340nm處的吸光度變化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×2瓶,4℃保存。 

試劑一:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑三:粉劑×1支,-20℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑四:粉劑×1支,-20℃避光保存。臨用前加1 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑五:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加4 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

 

酶液提取:

PGK酶提取:建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時間1min),然后4500g離心5min,取上清測定。

②胞漿和葉綠體PGK酶的分離:按照植物組織質量(g):提取液體積(mL)1510的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液),冰浴勻漿后于4500g離心5min,棄沉淀,取上清在48000g離心10min,取上清用于測定胞漿PGK酶活性,取沉淀加1mL提取液,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時間1min),然后4500g離心5min,取上清測定葉綠體中PGK酶活性。

建議測定總PGK酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測定胞漿和葉綠體中的PGK,則按照步驟②提取粗酶液。

 

測定操作:

1.        分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2.        微量石英比色皿/96孔板,依次加入100μL試劑一,20μL試劑二,10μL試劑三,10μL試劑四,40μL試劑五,20μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm10s的吸光值A1310s的吸光值A2,△A=A1-A2

 

 

計算公式

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PGKnmol/min /mg prot)=ΔA÷ε×d×V反總÷(V×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2)按照樣本質量計算

酶活單位定義:每組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PGKnmol/min /g 鮮重)=ΔA÷ε×d×V反總÷(W ×V÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總:反應體系總體積,0.2mLεNADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應時間,5 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g

 

b.       96孔板測定的計算公式如下

1)按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PGKnmol/min /mg prot)=ΔA÷ε×d×V反總÷(V×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

2)按照樣本質量計算

酶活單位定義:每組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PGKnmol/min /g 鮮重)=ΔA÷ε×d×V反總÷(W ×V÷V樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

V反總:反應體系總體積,0.2mLεNADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應時間,5 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g

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