丙酮酸羧化酶(PC)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中,催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,是糖異生過程的第一個限速酶,在保證血糖的動態平衡方面起著重要的作用。
測定原理:
PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+,在340nm下測定NADH氧化速率,即可反映PC活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體18 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:液體13uL×1支,4℃保存;
試劑三:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細菌或細胞,加入1mL提取液,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g,4℃離心5min。
3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的PC(此步可選做)。
5、 在步驟④的沉淀中加入1mL提取液,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體PC活性測定。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三轉移到試劑一中混合溶解待用;置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱5分鐘;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
試劑四的配制:在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
2、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.5,需將樣本用提取液稀釋適當倍數后測定,使ΔA小于0.5可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。
PC活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PC(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PC(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
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