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果糖-1,6-二磷酸酶試劑盒說(shuō)明書(shū)

閱讀:305      發(fā)布時(shí)間:2023-10-26
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果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphataseFBP)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                            微量法100/96

 

   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

果糖-1,6二磷酸酶又稱果糖1,6二磷酸酯酶,催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無(wú)機(jī)磷,在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guān)鍵性的作用。

 

測(cè)定原理:

FBP催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無(wú)機(jī)磷在反應(yīng)體系中添加的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH340nm下測(cè)定NADPH增加速率,即可計(jì)算FBP活性。

 

需自備的儀器和用品:

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入20mL試劑四充分溶解待用,用不完的試劑4保存;

試劑二:液體7.2μL×1支,4保存;臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用,用不完的試劑4保存;

試劑三:粉劑×1支,-20保存;臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用,用不完的試劑4保存;

試劑四:液體25mL×1瓶, 4保存;

 

樣本的前處理:

FBP酶提取:建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后48000g離心10min,取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體FBP酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)1510的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一),冰浴勻漿后于4200g離心5min,棄沉淀,取上清在48000g離心10min,取上清用于測(cè)定胞漿FBP酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后48000g離心10min,取上清測(cè)定葉綠體中FBP酶活性。

建議測(cè)定總FBP酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的FBP,則按照步驟②提取粗酶液。

 

測(cè)定步驟:

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   將試劑一、二、三37℃(哺乳動(dòng)物)25(其它物種)預(yù)熱10分鐘。

3、   加樣表

試劑名稱μL

測(cè)定管

樣本

20

試劑二

10

試劑三

10

試劑一

160

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿或96孔板中,立即混勻,加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),在340 nm波長(zhǎng)下記錄反應(yīng)1min后吸光度A1反應(yīng)6min的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A2-A1

 

FBP活性計(jì)算

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBPnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBPnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.02 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,5 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g

 

b. 96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBPnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBPnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,5 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g

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