磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/96樣
注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
PEPCK(EC 4.1.1.32)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中,催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸,是調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵酶。
測(cè)定原理:
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測(cè)定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體18 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:液體16.5uL×1支,4℃保存;
試劑三:粉劑×1支, -20℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
3、試劑四的配制:臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
4、將工作液和試劑四置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘。
5、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.1,需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定,使ΔA小于0.1可提高檢測(cè)
靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
PEPCK活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)PEPCK活力計(jì)算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPCK(nmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3215×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPCK活力計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPCK(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPCK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)PEPCK活力計(jì)算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPCK(nmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=6430×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPCK活力計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPCK(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPCK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=12.86×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。
提供商 |
優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
6次 |
資料大小 |
35KB | 資料類(lèi)型 |
WORD 文檔 |
資料圖片 |
點(diǎn)擊查看 | 瀏覽次數(shù) |
330次 |
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
立即詢(xún)價(jià)
您提交后,專(zhuān)屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)