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葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)試劑盒說(shuō)明書

閱讀:353      發(fā)布時(shí)間:2023-10-27
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葡萄糖-6-磷酸酶G6P)試劑盒說(shuō)明書

                                     微量法100/96


   意 :測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

葡萄糖-6-磷酸酶((glucose 6 phosphataseG6PaseEC 3.1.3.9廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中,是糖異生過(guò)程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶,在保證血糖的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要的作用。

 

測(cè)定原理:

G6P催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖,變旋酶和葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NAD+還原生成NADH,在340nm下測(cè)定NADH生成速率,即可反映G6P活性。

 

需自備的儀器和用品:

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體19 mL×1瓶, 4保存;

試劑二:粉劑×1支,-20保存;

試劑三:粉劑×1支,-20保存;

試劑四:試劑×1支,-20保存;

 

樣本的前處理:

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

工作液的配制:臨用前將試劑二、試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

2、   將工作液置于37℃(哺乳動(dòng)物)25(其它物種)預(yù)熱5分鐘。

3、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A1 2min后的吸光值A2計(jì)算ΔA=A2-A1

注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.3,需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定,使ΔA小于0.3可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

 

G6P活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)G6P活力計(jì)算

單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6Pnmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=1608×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6P活力計(jì)算

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6Pnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6Pnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6Pnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=3.215×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,1×10-3 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.05 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,2 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)G6P活力計(jì)算

單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6Pnmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=3216×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6P活力計(jì)算

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6Pnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6Pnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6Pnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=6.43×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,2 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

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