糖原合成酶(Glycogen synthase,GCS)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/96樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
GCS(EC 2.4.1.11)催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UTP,以α-1,4-糖苷鍵相連延長(zhǎng)糖鏈,是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶,是胰島素作用的主要靶酶,對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)和血糖穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用。
測(cè)定原理:
GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測(cè)定NADH下降速率,即可反映GCS活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體18 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:液體2.5mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體16.4uL×1支,4℃保存;
試劑四:粉劑×1支, -20℃保存;
試劑五:粉劑×1支, -20℃保存;
樣本的前處理:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液的配制:臨用前將試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
3、 試劑五的配制:臨用前在試劑五中加入1mL試劑二充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
4、 將工作液和試劑五置于37℃預(yù)熱5分鐘。
5、 在1mL微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.1,需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定,使ΔA小于0.1可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
GCS活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GCS(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GCS(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
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