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抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase,AAO)活性測定試劑盒說明書

閱讀:316      發(fā)布時間:2023-10-29
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抗壞血酸氧化酶ascorbate oxidaseAAO活性測定試劑盒說明書

                                                    微量法100T/96S

 

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

AAO是定位于植物細胞壁的糖蛋白,屬藍銅氧化酶"家族。細胞壁內的抗壞血酸和AAO與細胞壁的代謝和生長有著密切的聯(lián)系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過質膜上的細胞色素b還原,該過程中電子的跨膜運輸能夠促進細胞生長。

 

測定原理:

AAO可直接氧化AsA,通過測定AsA的氧化量,可計算得AAO活力。

 

實驗中所需儀器及設備:

低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可調式移液器、研缽、冰、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體20mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解。

 

粗酶液提取:

按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。16000g4離心10min,取上清置冰上待測。

 

AAO測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節(jié)波長到265 nm

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min

3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL預熱的試劑二和10μL試劑三,迅速混勻后在265nm測定10s130s光吸收A1A2A =A1-A2

 

AAO活性計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

AAO活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 1個酶活單位

AAO(nmol/min /mg prot) = A÷(ε×d×V反總×109÷(Cpr×V)÷T

= 92.4×A÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

AAO活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 1個酶活單位

 

AAO(nmol/min/g 鮮重) = A÷(ε×d×V反總×109÷(W×V÷V樣總)÷T

= 92.4×A÷W

εAsA265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol/cmd:比色皿光徑(cm),1 cm V反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4 L1061mol=1×106μmolCpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mL

T:催化反應時間(min),2min

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

AAO活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 1個酶活單位

AAO(nmol/min /mg prot) = A÷(ε×d×V反總×109÷(Cpr×V)÷T

=184.8×A÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

AAO活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 1個酶活單位

AAO(nmol/min/g 鮮重) = A÷(ε×d×V反總×109÷(W×V÷V樣總)÷T

= 184.8×A÷W

εAsA265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol/cmd96孔板光徑(cm),0.5 cm V反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4 L1061mol=1×106μmolCpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mL

T:催化反應時間(min),2min

 

注意事項:

配制好的試劑放在4℃保存,三天內使用完。

提供商

優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司

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