抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一,也是抗壞血酸代謝的關鍵酶之一。APX具有多種同功酶,分別定位于葉綠體、胞質、線粒體、過氧化物和乙醛酸體,以及過氧化體和類囊體膜上。APX 催化H2O2氧化AsA,是植 AsA 的主要消耗者。APX的活性直接影響到AsA的含量,APX與AsA具有一定的負相關性。
測定原理:
APX 催化H2O2氧化AsA,通過測定AsA氧化速率,來計算得APX活性。
自備儀器用品:
低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加3 mL蒸餾水充分溶解。
試劑三:液體3mL×1支,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。13000g,4℃離心20min,取上清置冰上待測。
測定:
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上,調節波長到290nm,用蒸餾水調零。
2. 試劑一在25℃中預熱30min。
3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL預熱的試劑一20μL試劑二和20μL試劑三,迅速混勻后在290nm測定10s和130s光吸收A1和A2,△A=A1-A2。
APX活性計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T
=1786×△A÷ Cpr
(2)按樣本質量計算
活性單位定義:每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
APX(nmol/min/g 鮮重 ) = △A÷(ε×d)×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1786×△A ÷W
ε:AsA在290nm處摩爾吸光系數為2.8×103 L/mol/cm;d:比色皿光徑(cm),1 cm;V反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;109:1mol=1×109nmol;Cpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:催化反應時間(min),2min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T
=3571×△A÷ Cpr
(2)按樣本質量計算
活性單位定義:每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
APX(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d)×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=3571×△A ÷W
ε:AsA在290nm處摩爾吸光系數為2.8×103 L/mol/cm;d:96孔板光徑(cm),0.5 cm;V反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;109:1mol=1×109nmol;Cpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:催化反應時間(min),2min。
注意事項:
配制好的試劑二4℃保存,并且3天內使用完。
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