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脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)試劑盒說明書

閱讀:343      發(fā)布時(shí)間:2023-10-29
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脫氫抗壞血酸還原酶dehydroascorbate reductaseDHAR試劑盒說明書

                                                   微量法100T/96S

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

DHAR存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中。DHAR催化GSH還原DHA生成AsAGSSG,調(diào)控細(xì)胞AsA/DHA比值,是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶。提高植物體內(nèi)的 DHAR 活性,可提高植物食品中AsA含量,進(jìn)而提高植物食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

 

測(cè)定原理:

DHAR催化GSH還原DHA生成AsA,通過測(cè)定DHA減少速率,計(jì)算DHAR活性。

 

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備:

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體17.5mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

 

粗酶液提取:

1.        按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);8000g 4離心20min,取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3.  血清等液體:直接測(cè)定。

 

DHAR測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到265nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL試劑三、20μL試劑四和140μL 試劑二,最后加20μL上清液迅速混勻后于265nm比色,記錄30s150s的吸光值A1A2A=A2-A1

 

DHAR活性計(jì)算公式:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

 

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1nmol AsA 1個(gè)酶活單位

 

DHAR(nmol/min/mg prot) = A÷ε÷d×V反總×109÷(Cpr×V)÷T

= 92×A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = A÷ε÷d×V反總×109÷(W×V÷V樣總)÷T

= 92×A ÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘還原生成1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V反總×109÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

= 92×A ÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = A÷ε÷d×V反總×109÷V÷T

= 92×A

ε AsA265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol /cm106:摩爾分子換算成微摩爾分子;d:比色杯光徑,1cmV反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4 LV樣:反應(yīng)體系中加入上清液體積,20μL =0.02mLV樣總:提取液體積,1 mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mLW :樣品質(zhì)量;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1nmol AsA 1個(gè)酶活單位

DHAR(nmol/min/mg prot) = A÷ε÷d×V反總×109÷(Cpr×V)÷T

= 184×A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = A÷ε÷d×V反總×109÷(W×V÷V樣總)÷T

= 184×A ÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘還原生成1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V反總×109÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

= 184×A ÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = A÷ε÷d×V反總×109÷V÷T

= 184×A

ε AsA265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol /cm106:摩爾分子換算成微摩爾分子;d96孔板光徑,0.5 cmV反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4 LV樣:反應(yīng)體系中加入上清液體積,20μL =0.02mLV樣總:提取液體積,1 mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mLW :樣品質(zhì)量;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min

 

注意事項(xiàng):

 

臨用前配制的試劑未使用完的4保存,3天內(nèi)使用完。

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優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司

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