單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
MDHAR催化MDHA還原生成AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。
測定原理:
MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsA和NAD+,NADH在340 nm有特征吸收峰,但是NAD+沒有。通過測定340 nm光吸收下降速率,來計算出MDHAR活性。
實驗中所需儀器及設備:
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和雙蒸水
試劑組成和配置:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體20mL×1瓶,室溫保存。
試劑三:粉劑×1瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入3 mL蒸餾水充分溶解。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。
試劑五:液體15μL×1瓶,4℃保存。臨用前加3 mL試劑二充分溶解。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
2. . 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);8000g ,4℃離心20min,取上清液置冰上混勻待測。
3. 血清等液體:直接測定。
MDHAR測定操作:
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到340 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。
3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL試劑三、20μL試劑四、20μL試劑五和120μL試劑二,最后加入20μL上清液,迅速混勻后于340nm比色,記錄30s和150s的吸光值30s和150s的吸光值A1和A2,△A=A1-A2。
MDHAR活性計算公式:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
MDHAR活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷(Cpr×V樣)÷T
= 804×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
MDHAR活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。
MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 804×△A ÷W
(3)按細胞數量計算
MDHAR活性單位定義:25℃中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 804×△A ÷ 細胞數量
(4)按液體體積計算
MDHAR活性單位定義:25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣)÷T
= 804×△A
ε:NADH摩爾消光系數,6220 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應體系總體積,0.2mL=2×10-4L;V樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定,建議使用本公司蛋白質含量BCA試劑盒;W :樣品質量;T:反應時間,2min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下:
(1). 按蛋白濃度計算
MDHAR活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷(Cpr×V樣)÷T
= 1608×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
MDHAR活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。
MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 1608×△A ÷W
(3)按細胞數量計算
MDHAR活性單位定義:25℃中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 1608×△A ÷ 細胞數量
(4)按液體體積計算
MDHAR活性單位定義:25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣)÷T
=1608×△A
ε:NADH摩爾消光系數,6220 L/mol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應體系總體積,0.2mL=2×10-4L;V樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定,建議使用本公司蛋白質含量BCA試劑盒;W :樣品質量;T:反應時間,2min。
注意事項:
臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存,3天內使用完。
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