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維生素B6(Vitamin B6,VB6)試劑盒說明書

閱讀:302      發布時間:2023-10-30
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維生素B6Vitamin B6VB6)試劑盒說明書

       微量法100T/96S

 

   :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

維生素B6Vitamin B6又稱吡哆素,其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺,在體內以磷酸酯的形式存在,是一種水溶性維生,在細胞中參與多種蛋白質和氨基酸的代謝,對生物體具有極其重要的作用。

 

測定原理:

VB64-氨基安替比林在強氧化劑作用下生成穩定的黃色化合物,在390nm有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器:

天平、研缽、離心機、可見分光光度計/酶標儀微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。

 

試劑組成和配制

提取液:液體70mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體1mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體5mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑四:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。

 

樣本處理:

1.        組織:將樣品磨碎,按照質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入0.6mL提取液)加入提取液,60℃浸提30min,加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測定(動物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘)。

2.        細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入0.6mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測定。

3.        血清:直接測定。               

 

測定操作:

 


空白管

測定管

樣品(μL


40

試劑一(μL

40


試劑二(μL

40

40

試劑三(μL

60

60

試劑四(μL

60

60

充分混勻,25℃反應20min,于微量石英比色皿/96孔板,測定390nm處吸光值,記為A空白管和A測定管,△A=A測定管-A空白管。空白管只要做一管。

 

 

計算公式:
a.
用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線:y = 0.3635x+0.0205R2 = 0.9986

1. 按照蛋白含量計算

VB6含量(μg/mg prot=(△A - 0.0205÷ 0.3635×V反總÷V×Cpr

                    = 13.76×(△A - 0.0205÷ Cpr

2. 按照樣本質量計算

VB6含量(μg/g=(△A - 0.0205÷ 0.3635×V反總÷V×W÷V樣總)

                = 13.76×(△A - 0.0205÷ W

3. 按照細胞數量計算

VB6含量(μg/104 cell=(△A - 0.0205÷ 0.3635×V反總÷V×細胞數量÷V樣總)

                     = 13.76×(△A - 0.0205÷ 細胞數量

4. 按照液體體積計算

VB6含量(μg/mL=(△A - 0.0205÷ 0.3635×V反總÷V

                  = 13.76×(△A - 0.0205

V反總:反應總體積,0.2mL;:V樣:加入樣本體積,0.04mLV樣總:加入提取液體積,1mL Cpr:蛋白濃度,mg/mLW:樣本質量,g

 

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y = 0.1818x+0.0205R2 = 0.9986

1. 按照蛋白含量計算

VB6含量(μg/mg prot=(△A - 0.0205÷ 0.1818×V反總÷V×Cpr

                    = 27.52×(△A - 0.0205÷ Cpr

2. 按照樣本質量計算

VB6含量(μg/g=(△A - 0.0205÷ 0.1818 ×V反總÷V×W÷V樣總)

                = 27.52×(△A - 0.0205÷ W

3. 按照細胞數量計算

VB6含量(μg/104 cell=(△A - 0.0205÷ 0.1818×V反總÷V×細胞數量÷V樣總)

                     = 27.52×(△A - 0.0205÷ 細胞數量

4. 按照液體體積計算

VB6含量(μg/mL=(△A - 0.0205÷ 0.1818×V反總÷V

                  =27.52×(△A - 0.0205

V反總:反應總體積,0.2mL;:V樣:加入樣本體積,0.04mLV樣總:加入提取液體積,1mL Cpr:蛋白濃度,mg/mLW:樣本質量,g

 

注意事項

1.        若測定結果中吸光值超過1,請將樣本稀釋后進行測定,并在計算公式中乘以稀釋倍數。

2.        蛋白濃度較高的樣品,比如動物組織,若顯色完成后有沉淀產生,將樣本稀釋后再測定,在計算公式中乘以稀釋倍數。

3.        顯色完成后立即進行測定。

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優利科(上海)生命科學有限公司

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