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線粒體復合體Ⅰ測試盒說明書

閱讀:338      發(fā)布時間:2023-10-31
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線粒體復合體試劑盒說明書

                                     微量法100/96

 

   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

復合體EC 1.6.5. 3又稱NADH-CoQ 還原酶NADH脫氫酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,是線粒體內膜中最大的蛋白復合物。該酶催化一對電子從NADH傳遞給CoQ,同時可使O2還原生成O2.-,是呼吸電子傳遞鏈上產生O2.-的主要部位。測定該酶活性,不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈(ETC)狀態(tài),而且可以反映活性氧(ROS)生成狀態(tài)。

 

測定原理

復合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD+,在340nm下測定NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

試劑一:液體100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:液體20mL×1瓶,-20保存;

試劑三液體1.5mL×1瓶,-20保存;

試劑四:液體25mL×1瓶,-20保存;

試劑五:液體1mL×1支,-20保存;

試劑六:粉劑×1支,-20保存,用時加入2mL蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

工作液的配制:臨用前將試劑五轉移到試劑四中混合溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

 

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

        準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

        將勻漿600g4離心5min

        棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4離心10min

        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅰ(此步可選做)。

        步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體Ⅰ酶活性測定

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至340nm,蒸餾水調零。

2、  樣本測定

1)工作液于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六,混勻,記錄340nm處初始吸光值A1 2min后的吸光值A2計算ΔA=A1-A2

 

復合體活力單位的計算

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1)按蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅰ活力(nmol/min /mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅰ活力(nmol/min/g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=365×ΔA÷W

3 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.25×10-4 LεNADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2 minW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

1)按蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅰ活力(nmol/min/mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅰ活力(nmol/min/g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=730×ΔA÷W

3 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅰ活力(nmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=1.46×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.25×10-4 LεNADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2 minW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

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