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線粒體復合體Ⅱ試劑盒說明書

閱讀:329      發布時間:2023-11-01
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線粒體復合體試劑盒說明書

                                          微量法100/96


   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

線粒體復合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同時輔基FAD還原為FADH2,后者進一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q,是呼吸電子傳遞鏈的支路。

 

測定原理:

復合體Ⅱ的催化產物還原型輔酶Q可進一步還原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計算該酶活性。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:液體20mL×1瓶,-20保存;

試劑三液體1.5mL×1支,-20保存;

試劑四:液體25mL×1瓶,4保存;

試劑五:粉劑×1支,-20保存;

試劑六:液體2.5mL×1瓶,4保存;

 

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、   準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g4離心5min

3、   棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4離心10min

4、   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅱ(此步可選做)。

5、   步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體Ⅱ酶活性測定

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至605nm,蒸餾水調零。

2、  樣本測定

1)工作液的配制:臨用前把試劑五轉移到試劑四中混合溶解,置37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、25μL試劑六和200μL工作液,立即混勻,記錄

 

605nm處初始吸光值A1 2min后的吸光值A2計算ΔA=A1-A2

 

復合體活力單位的計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

 復合體活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

 復合體活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=113×ΔA÷W

3 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

復合體活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T =0.226×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.35×10-4 Lε2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數,2.1×104 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

1 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

 復合體活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T=1118×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

 復合體活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=226×ΔA÷W

3 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

復合體活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.452×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.35×10-4 Lε2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數,2.1×104 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

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