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線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說(shuō)明書

閱讀:334      發(fā)布時(shí)間:2023-11-01
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線粒體復(fù)合體試劑盒說(shuō)明書

                                          微量法100/96


   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

線粒體復(fù)合體Ⅲ(EC 1.10.2.2又稱CoQ-細(xì)胞色素C還原酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負(fù)責(zé)把還原型CoQ的氫傳遞給細(xì)胞色素C,生成還原型細(xì)胞色素C

 

測(cè)定原理:

與氧化型細(xì)胞色素C不同,還原型細(xì)胞色素C550nm有特征光吸收,因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性。

 

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:液體20mL×1瓶,-20保存;

試劑三液體1.5mL×1支,-20保存;

試劑四:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑五:粉劑×1支,-20保存;

試劑六:液體2.5mL×1瓶,-20保存;

 

樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、   準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g4離心5min

3、   棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4離心10min

4、   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ(此步可選做)。

5、   步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測(cè)定

 

測(cè)定步驟:

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

1)工作液的配制:將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,置37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)孵育5min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、25μL試劑六和200μL工作液,立即混勻,記錄

 

550nm處初始吸光值A1 2min后的吸光值A2計(jì)算ΔA=A2-A1

 

復(fù)合體Ⅲ活力單位的計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

1 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=124×ΔA÷W

3 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.248×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2.35×10-4 Lε細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù),1.91×104 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應(yīng)時(shí)間,2 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。

 

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

1 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1230×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=248×ΔA÷W

3 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.496×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2.35×10-4 Lε細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù),1.91×104 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應(yīng)時(shí)間,2 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。


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