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線粒體復合體Ⅳ試劑盒說明書

閱讀:318      發布時間:2023-11-01
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線粒體復合體試劑盒說明書

                                          微量法100/96


   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

線粒體復合體又稱細胞色素C氧化酶,也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負責催化還原型細胞色素C的氧化,并最終把電子傳遞給氧,生成水。

 

測定原理:

還原型細胞色素C550nm有特征光吸收,線粒體復合體Ⅳ催化還原型細胞色素C生成氧化型細胞色素C,因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復合體Ⅳ酶活性。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:液體20mL×1瓶,-20保存;

試劑三液體1.5mL×1瓶,-20保存;

試劑四:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑五:粉劑×1支,-20保存;

試劑六粉劑×1支,-20保存;

 

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、   準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g4離心5min

3、   棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g4離心10min

4、   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅳ(此步可選做)。

5、   步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體Ⅳ酶活性測定

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至550nm,蒸餾水調零。

2、  樣本測定

1)工作液的配制:臨用前將試劑五和試劑六依次轉移到試劑四中混合溶解,置37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和200μL工作液,混勻,記錄550nm處初始吸光值A1 37℃反應30min后的吸光值A2計算ΔA=A1-A2

 

注意點:

1、ΔA大于0.2,需將樣本用試劑二稀釋適當倍數(計算公式中乘以相應稀釋倍數),使A1-A2小于0.2,可提高檢測靈敏度。

2、動物肝臟樣本由于酶活性過高, 1分鐘內吸光值就會到達平臺期,務必先進行2個樣本的預測定。可將樣本用試劑二稀釋10~50倍,反應時間縮到到30秒或1分鐘(計算公式中代入實際反應時間,并乘以相應稀釋倍數)。其他樣本可按照正常測定步驟進行。

 

復合體Ⅳ活力單位的計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)÷T=3.88×ΔA÷W

3 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=0.008×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.2×10-4 Lε細胞色素C摩爾消光系數,1.91×104 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.02 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,30 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

1 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=38.39×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)÷T=7.76×ΔA÷W

3 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=0.016×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.2×10-4 Lε細胞色素C摩爾消光系數,1.91×104 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.02 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,30 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

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