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線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書

閱讀:311      發布時間:2023-11-01
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線粒體復合體試劑盒說明書

                                          微量法100/48

 

 

   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中,由F1F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產生的質子電化學梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。

 

測定原理:

復合體水解ATP產生ADPPi,通過測定Pi增加速率來測定復合體活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

試劑一:100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:80mL×1瓶,-20保存;

試劑三2 mL×1瓶,-20保存;

試劑四:粉劑×1-20保存;臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20保存;

試劑五:8mL×1瓶,4保存;

試劑六:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入4mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4保存一周;

試劑七:粉劑×1, 4保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4保存一周;

試劑八:粉劑×1, 4保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4保存一周;

試劑九:液體10mL×1 瓶,室溫保存。

定磷試劑的配制:H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染(請根據需要,用多少配多少)。

注意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

 

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

        準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

        將勻漿600g4離心5min

        棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4離心10min

        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體(此步可選做)。

        步驟④中的沉淀即為線粒體,加入800uL試劑二和8uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體酶活性測定。

 

 

測定步驟:

1、酶促反應(在EP管中加入下列試劑)

試劑名稱(μL

對照管

測定管

試劑

10

10

試劑五

40

40

 樣本  


50

混勻, 37(哺乳動物)或25(其它物種)準確水浴30min

試劑六

20

20

樣本

50


混勻,4000g,25離心10min,取上清液

2、定磷(EP管或96孔板中加入下列試劑)

上清液

30

30

定磷試劑

170

170

混勻,室溫靜置10min后,在 660nm處讀取A測定管和A對照管,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。

 

復合體活性計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

標準條件下測定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004x為標準品濃度(mmol/L),yA值。

1、組織中復合體活性的計算:

1 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

 復合體活性(nmol/min/mg prot=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(V×Cpr) ÷T

                         =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

 復合體Ⅴ活性(nmol/min /g 鮮重=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(W× V÷V樣總) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

3 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min /104 cell=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V反總:反應體系總體積,1.2×10-4 L V樣:加入樣本體積,0.05 mL;V樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.637x + 0.004;x為標準品濃度(mmol/L),yA值。

1 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

 復合體Ⅴ活性(nmol/min /mg prot=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反總×106]÷(V×Cpr) ÷T

                       

 =125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

 復合體Ⅴ活性(nmol/min /g 鮮重=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反總×106]÷(W× V÷V樣總) ÷T

                         =101.5× (ΔA-0.004) ÷W

3 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min /104 cell=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反總×106]÷(500×V÷V樣總) ÷T

                         =0.203× (ΔA-0.004)

V反總:反應體系總體積,1.2×10-4 L; V樣:加入樣本體積,0.05 mLV樣總:加入提取液體積,0.808 mLT:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬。

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