線粒體轉氫酶-1(TH-1)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
TH位于線粒體的內膜上,又稱為呼吸電子傳遞鏈復合體六,催化NADH+NADP+和 NAD++NADPH相互轉化。催化正向反應稱為TH-1。線粒體NADH含量增加時會導致線粒體膜的H+電化學梯度升高,因而促進了電子傳遞鏈上ROS的產生。TH-1促進NADH轉換為NADPH,從而提高線粒體的抗氧化能力。
測定原理:
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的轉氫反應不能導致340nm吸光度發生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP+)替代NADP+,TH-1催化 APADP+還原生成的APADPH在375nm有特征光吸收,因此通過測定375nm光吸收增加速率,來計算TH-1活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:液體50mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體18mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑五:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g,4℃離心5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的TH-1(此步可選做)。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入500uL試劑二,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于TH-1活性測定。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至375nm,蒸餾水調零。
2、 樣本測定
(1)工作液的配制:臨用前將試劑四、五轉移到試劑三中混合溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液,混勻,立即記錄375nm處初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
TH-1活性計算:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位。
TH-1活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘產生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位。
TH-1活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位。
TH-1活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.149×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:APADPH摩爾消光系數,6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,0.5mL;T:反應時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位。
TH-1活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘產生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位。
TH-1活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=149×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位。
TH-1活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.298×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:APADPH摩爾消光系數,6.7×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,0.5mL;T:反應時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
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