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過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)試劑盒說(shuō)明書(shū)

閱讀:323      發(fā)布時(shí)間:2023-11-02
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過(guò)氧化物酶(PeroxidasePOD)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                          微量法100/96

 

   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

PODEC 1.11.1.7廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,可催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物,具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。

 

測(cè)定原理:

POD催化H2O2氧化特定底物,在470nm有特征光吸收。

 

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體25mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:液體100μL×1支,4℃保存;

試劑三:液體100μL×1支,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至470nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   工作液的配制:臨用前將試劑一、試劑二、試劑三按照2.6mL):1.5μL):1μL)的比例混勻;在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10min以上;現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,混勻,記錄470nm1min時(shí)吸光值A12min后的吸光值A2。計(jì)算ΔAA2-A1。

 

注意:

如果ΔA小于0.005,可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到5min。如果ΔA大于0.5,可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定,計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

 

POD活性計(jì)算:

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)POD活性

單位定義:每mL血清(漿)在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

計(jì)算公式:

PODU/mL=ΔA×V反總÷V÷0.01÷T =2000×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

PODU/mg prot)=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

PODU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.01÷T =2000×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

PODU/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.01÷T =4×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL V樣:加入樣本體積,0.01mLV樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

 

96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)POD活性

單位定義:每mL血清(漿)在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.005為一個(gè)酶活力單位。

PODU/mL=ΔA×V反總÷V÷0.005÷T =4000×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.005為一個(gè)酶活力單位。

PODU/mg prot)=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.005÷T =4000×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.005為一個(gè)酶活力單位。

PODU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.005÷T =4000×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.005為一個(gè)酶活力單位。

PODU/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.005÷T =8×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL; V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,1 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

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