黃嘌呤氧化酶(xanthione oxidase, XOD)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
XOD(EC 1.17.3.2)催化黃嘌呤氧化生成尿酸和超氧陰離子,是活性氧主要來源之一;同時也是核苷酸代謝的關鍵酶之一。XOD主要分布于哺乳動物的心,肺,肝臟等組織中,當肝功能受損時,XOD大量釋放到血清中,對肝損害的診斷具有特異性的意義。
測定原理:
XOD催化黃嘌呤產生尿酸,尿酸在290nm下有特征吸收峰。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:30mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×2瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
操作步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至290nm,蒸餾水調零。
2、 XOD檢測工作液的配制:用時在每瓶試劑二中加入15mL試劑一,充分混勻,待用;現配現用;
3、 測定前將XOD檢測工作液在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。
4、 準備96孔UV板一塊(非普通酶標板,普通酶標板只能透過可見光,不能透過紫外光,檢測波長小于340nm務必使用UV板)。
5、在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和250μL工作液,立即混勻并計時,記錄290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計算ΔA=A2-A1。
XOD活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)XOD計算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化產生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。
XOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=2131×ΔA
2、組織、細菌或細胞中XOD計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。
XOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。
XOD(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=2131×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。
XOD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=4.26×ΔA
V反總:反應體系總體積,2.6×10-4 L;ε:尿酸摩爾消光系數,1.22×104 L/ mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;500:細胞或細菌總數,500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)XOD計算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化產生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。
XOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=4262×ΔA
2、組織、細菌或細胞中XOD計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。
XOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T =4262×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。
XOD(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T =4262×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。
XOD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=8.52×ΔA
V反總:反應體系總體積,2.6×10-4 L;ε:尿酸摩爾消光系數,1.22×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;500:細胞或細菌總數,500萬。
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