超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)試劑盒說明書(WST-8 法)
微量法 100 管/96 樣
注 意:正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
SOD(EC 1.15.1.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,催化超氧化物陰離子發生岐化作用,生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶,也是 H2O2 主要生成酶,在生物抗氧化系統中具有重要作用。
測定原理:
通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子(O2-),O2-可與 WST-8 反應產生水溶性染料甲臜,后者在 450nm 處有吸收;SOD 可清除 O2-,從而抑制了甲臜的形成;反應液黃色越深,說明 SOD 活性愈低,反之活性越高。
需自備的儀器和用品:
酶標儀、離心機、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 20mL×1 瓶,4℃避光保存;
試劑二:液體 150μL×1 支,4℃避光保存;
試劑三:液體 100μL×1 支,4℃保存;
試劑四:粉劑×2 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 450nm。
2、 試劑三的稀釋:將試劑三用蒸餾水稀釋 50 倍,用多少配多少。(試劑三和蒸餾水 1:49稀釋。
3、 工作液配制:在試劑一加入 100μL 試劑二,充分混勻。配好的試劑 4℃避光可保存一周。(若一次性測定樣本較少,可按照實際用量將試劑一和試劑二按照 20mL:0.1mL 的比例混勻配制)
4、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解(溶解后一周內用完)。
5、 樣本測定(在 96 孔板中依次加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 10 | |
蒸餾水 | 10 | |
試劑三(稀釋后) | 10 | 10 |
工作液 | 160 | 160 |
試劑四 | 20 | 20 |
充分混勻,室溫靜置 30min 后,450nm 處測定各管吸光值 A。
注意事項:
1、試劑三為酶,不可冷凍,使用時在冰上放置。
2、對照管只需要做一管。
3、SOD 為什么有的樣本測定管大于對照管,對照管數值在什么范圍?
對照管的范圍是 0.4-1。對照管吸光值過低可能是(1)試劑三活性低,可以適當減少稀釋倍數;(2)沒有按順序加試劑;(3)反應時間不夠,可以延長反應時間(反應時間 30min可以延長到 40min)。對照管吸光值過高可能是試劑三未按操作說明書稀釋相應倍數。若出現測定管大于對照管,可能是樣本中雜質的影響太大,為了降低雜質的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測,通常可以使測定正常。計算公式中乘以相應稀釋倍數。
SOD 活性計算:
1、抑制百分率的計算
抑制百分率=(A 對照管-A 測定管) ÷A 對照管× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內。如果計算出來的抑制百分率小于 10%或大于90%,則通常需要調整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高,則需將樣本用提取液適當稀釋;如果測定出來的抑制百分率偏低,則需重新準備濃度比較高的待測樣本。
2、SOD 酶活性單位:
3、在上述黃嘌呤氧化酶藕聯反應體系中抑制百分率為 50%時,反應體系中的 SOD 酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。
3、SOD 酶活性計算:
(1)血清(漿)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷V 樣=20×抑制百分率÷(1-抑制百分率)
(2)組織、細菌或培養細胞 SOD 活力計算:
a.按樣本蛋白濃度計算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)
=20×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。
b.按樣本鮮重計算
SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =20×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W
c.按細菌或細胞個數計算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)
=0.04×抑制百分率÷(1-抑制百分率)
V反總:反應體系總體積,0.2mL;V 樣:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;
V 樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL ;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。
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