單寧酶（Tannase，TAN）試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖。
測定原理：
使用抗氧化劑沒食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應的底物，在270nn下測定底物PG反應前后的光密度變化,計算單寧酶酶活力。
需自備的的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制：
試劑一：液體100mL×2瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前每支加入6mL試劑一，充分溶解后備用；用不完的試劑4℃保存；
粗酶液提取：
按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
液體樣本：直接取上清測定。
測定步驟：
1、分光光度計預熱30min以上，調節波長到270 nm，蒸餾水調零。
2、加樣表
試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 |
95℃水浴5min后滅活的粗酶液 | 50 | |
粗酶液 | 50 | |
試劑二 | 50 | 50 |
混勻，40℃準確保溫10 min后，置95℃水浴中10 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻
試劑一 | 900 | 900 |
混勻，取200uL至微量石英比色皿或96孔UV板中，270nm處讀取各管吸光值。計算ΔA=A對照-A測定。每個測定管需設個一個對照管。
注意：
1.可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進行5min 95℃沸水浴處理。
2.務必使用96孔UV板（非普通酶標板，普通酶標板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測波長小于340nm務必使用UV板）。
TAN活力單位的計算
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準條件下測定回歸方程為y = 0.0058x + 0.0044，R2 = 0.9994；x為PG含量（µmol/L），y為吸光值。
1、按樣本體積計算
單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位。
TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T
=34.48×( ΔA-0.0044）
2、按照蛋白濃度計算
單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性((µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T
=34.48×(ΔA-0.0044）÷Cpr
3、按照樣本鮮重計算
單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性(µmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=34.48×(ΔA-0.0044）÷W
V反總：反應體系總體積，1mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準條件下測定回歸方程為y = 0.0029x + 0.0044，R2 = 0.9994；x為PG含量（µmol/L），y為吸光值。
1、按樣本體積計算
單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T
=68.97×( ΔA-0.0044）
2、按照蛋白濃度計算
單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少1µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性(µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T
=68.97×( ΔA-0.0044）÷Cpr
3、按照樣本鮮重計算
單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性(µmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=68.97×( ΔA-0.0044）÷W
V反總：反應體系總體積，1mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。
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