多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
PPO(EC1.10.3.1)主要存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,是一種含銅的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化產生醌,從而引起褐化,與果蔬加工、茶葉品質和組培等密切相關。
測定原理:
PPO能夠催化鄰苯二酚產生醌,后者在525nm有特征光吸收。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:5mL×1瓶,4℃保存;
粗酶液提取:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)或果汁樣本的處理:
按照血清(漿)或果汁體積(mL):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取0.1mL血清(漿)或果汁加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至525nm,蒸餾水調零。
2、 樣本測定(在EP管中依次加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 50 | |
煮沸的樣本 | 50 | |
試劑一 | 200 | 200 |
試劑二 | 50 | |
蒸餾水 | 50 |
37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)中準確水浴10min后,95℃水浴5min,冷卻至室溫,10000g,25℃離心10min,收集上清,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,525nm處檢測測定管和對照管吸光度,計算ΔA=A測定-A對照。
注意:煮沸樣本的操作:取300μL離心上清于EP管中,進行5min 95℃水浴處理;每個測定管需要設一個對照管,可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液,然后集中進行5min 95℃水浴處理。
PPO活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)或果汁PPO活性
單位的定義:每分鐘每mL血清(漿)或果汁在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化
0.01為一個酶活力單位。
PPO(U/mL)=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液
2、組織、細菌或細胞PPO活性
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個
酶活力單位。
PPO(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個
酶活力單位。
PPO(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位定義:每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。
PPO(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =0.12×ΔA
V反總:反應體系總體積,0.3mL;V液:加入血清(漿)或果汁體積,0.1mL; V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)或果汁PPO活性
單位的定義:每分鐘每mL血清(漿)或果汁在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化
0.005為一個酶活力單位。
PPO(U/mL)=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷V液
2、組織、細菌或細胞PPO活性
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個
酶活力單位。
PPO(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個
酶活力單位。
PPO(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位定義:每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個酶活力單位。
PPO(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =0.24×ΔA
V反總:反應體系總體積,0.3mL;V液:加入血清(漿)或果汁體積,0.1mL; V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬。
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