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多功能氧化酶((mixed function oxidase,MFO)試劑盒說明書

閱讀:344      發(fā)布時間:2023-11-07
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多功能氧化酶((mixed function oxidaseMFO)試劑盒說明書

                                        微量法100/96


   正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

多功能氧化酶又稱混合功能氧化酶,可產(chǎn)生降解反應(yīng),可使原化學(xué)物質(zhì)變?yōu)榈投镜幕驘o毒的物質(zhì)從體內(nèi)排出;還可產(chǎn)生激活反應(yīng),可使原化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有親電子性質(zhì),導(dǎo)致毒性增強(qiáng),成為致突變物或終致癌物。近年來對混合功能氧化酶系與外源性化學(xué)物質(zhì)相互作用的深入研究,對于從分子生物學(xué)水平上進(jìn)一步了解外源性化學(xué)物質(zhì)的毒作用具有重要意義。

 

測定原理

MFO催化對硝基苯甲醚產(chǎn)生對硝基苯酚,在400nm下有特征吸光值。

自備用品:

酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水、氯仿。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體120mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體24mL×1瓶,4℃避光保存;

試劑二:粉劑×3管,-20℃保存;臨用前取一管加入1.5mL水溶解,現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑三:液體24mL×1瓶,4℃保存;

試劑四:液體64mL×1瓶,4℃保存。

 

粗酶液提取:

按照組織質(zhì)量(g):提取液(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心20min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟:

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至400nm

2、在EP管中依次加入如下試劑

試劑名稱(μL

測定

空白

試劑一

200

200

試劑二

40

40

提取液

160

360

樣本

200


混勻,37℃水浴30min

試劑三

200

200

分別加入1000μL氯仿,充分混勻萃取,靜置10min,取下層氯仿層0.6mL至新的EP管中。再加入試劑四0.6mL,充分混勻萃取,取上層水相0.2mL96孔板中,400nm下測定吸光值A測定與A空白,A=A

 

-A空白。空白管只需測一管。

 

MFO活性計算:

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0119x + 0.0021R2 = 0.9997y,吸光度;x,標(biāo)準(zhǔn)品濃度,單位nmol/mL

(1)按樣本質(zhì)量計算

單位定義:每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

MFOnmol/min/g 鮮重)=△A-0.0021÷0.0119×V÷(V÷V樣總×W)÷T

                        =8.4×△A-0.0021÷W

(2)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

MFOnmol/min/mg prot=△A-0.0021÷0.0119×V÷(V×Cpr)÷T

                        =8.4×△A-0.0021÷Cpr

V總:最終萃取液體積,0.6 mLV樣:反應(yīng)中樣品體積,200μLT:反應(yīng)時間,30minW:樣品質(zhì)量,gCpr:樣本蛋白濃度,mg/mL

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優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司

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