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二胺氧化酶(Diamine Oxidase,DAO)試劑盒說明書

閱讀:359      發布時間:2023-11-07
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二胺氧化酶(Diamine OxidaseDAO)試劑盒說明書

                                                     微量法100T/48S

 

   正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動物(腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等)、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛,其活性與核酸和蛋白合成密切相關,能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度。

 

測定原理:

DAO催化尸胺產生醛和過氧化氫,外源添加過量的辣根過氧化物酶,催化過氧化氫氧化鄰聯茴香胺生成氧化型鄰聯茴香胺,在460nm處有特征吸收峰,通過測定該波長吸光度增加速率,計算DAO活性。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體120mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體0.3mL×1支,4℃保存。

試劑二:液體2.5mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體1.2mL×1管,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后10000g4℃離心20min,取上清,置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體:直接測定。

 

測定操作表:

1、分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長至460nm,蒸餾水調零。

2、操作表


對照管

測定管

粗酶液(μL

50

50

提取液(μL

128

108

試劑一(μL

2

2

試劑二(μL

20

20

試劑三(μL


20

混勻,37℃水浴30min微量石英比色皿/96孔板,蒸餾水調零,測定460nm吸光值ΔA=A測定-A對照。

 

 

酶活性計算公式:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,毫克組織蛋白每分鐘催化產生1nmol H2O2所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

DAO活性(nmol/min/mg prot= ×V反總÷V×Cpr÷T= 18×A460÷Cpr

2)按樣本質量計算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,組織每分鐘催化產生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/g 鮮重)= ×V反總÷V÷V樣總×W÷T= 18×A460÷W

3)按細胞數量計算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,104個細胞每分鐘催化產生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/104cell= ×V反總÷V÷V樣總×細胞數量)÷T= 18×A460÷細胞數量

 

(4) 按液體體積計算

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,毫升血清每分鐘催化產生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/mL= ×V反總÷V÷T= 18×A460

ε:氧化型鄰聯茴香胺毫摩爾消光系數:7.5 L/mmol/cmd:比色皿光徑,1cmV反總:反應總體積,0.2mLV樣:反應中樣本體積,0.05mLV樣總:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mLW:樣本質量,gT:反應時間,30min

b. 96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,毫克組織蛋白每分鐘催化產生1nmol H2O2所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

DAO活性(nmol/min/mg prot= ×V反總÷V×Cpr÷T= 36×A460÷Cpr

2)按樣本質量計算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,組織每分鐘催化產生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/g 鮮重)= ×V反總÷V÷V樣總×W÷T= 36×A460÷W

 

3)按細胞數量計算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,104個細胞每分鐘催化產生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/104cell= ×V反總÷V÷V樣總×細胞數量)÷T= 36×A460÷細胞數量

(4) 按液體體積計算

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,毫升血清每分鐘催化產生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/mL= ×V反總÷V÷T= 36×A460

ε:氧化型鄰聯茴香胺毫摩爾消光系數:7.5 L /mmol/cmd96孔板光徑,0.5cmV反總:反應總體積,0.2mLV樣:反應中樣本體積,0.05mLV樣總:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mLW:樣本質量,gT:反應時間,30min

 

注意事項:

1、如果OD值小于0.01,適當加大提取用樣本量;OD值大于0.8,粗酶液可適當稀釋,或者減少提取用樣本量。

2、樣品蛋白質含量需要另外測定。

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優利科(上海)生命科學有限公司

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