非蛋白巰基測定試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功能,對生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。
測定原理:
巰基基團與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸(DTNB)反應,生成黃色化合物,在412nm處有最大吸收峰。
自備實驗用品:
天平、研缽、恒溫水浴鍋、酶標儀、96孔板、乙醇和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100 mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體18 mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體1mL×1管,4℃避光保存。
樣品的制備:
1. 按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 血清,培養(yǎng)液:取0.1mL樣本,加入0.4mL提取液,混勻,室溫靜置10min, 然后8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
操作步驟:
1、 酶標儀預熱30min,調(diào)節(jié)波長至412nm。
2、 操作表
在96孔板中加入如下試劑
對照管 | 測定管 | |
樣品(μL) | 40 | 40 |
試劑一(μL) | 150 | 150 |
試劑二(μL) | 10 | |
乙醇(μL) | 10 | |
混勻,25℃靜置10min,測定412nm吸光值。ΔA=A測定-A對照。每個測定管設一個對照管。 |
計算公式:
非蛋白巰基標準曲線:y = 1.8111x - 0.0037,R2 = 1,x為標品濃度,單位μmol/mL,y為吸光度ΔA。
1. 組織:
(1)按樣本重量計算
非蛋白巰基含量(μmol/g 鮮重)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×V樣總÷W
=0.552×(ΔA+0.0037)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算
非蛋白巰基含量(μmol/mg prot)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×V樣總÷Cpr
=0.552×(ΔA+0.0037)÷Cpr
2. 血清、培養(yǎng)液:
非蛋白巰基含量(μmol/L)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×5×103
=2761×(ΔA+0.0037)
V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質(zhì)量,g ;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;5:血清,培養(yǎng)液等液體樣本稀釋倍數(shù);103 :1mmol/ L=103μmol/ L
注意事項:
Z低檢出限為10μmol/L。
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