過氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒(紫外吸收法)說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是最主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。
測(cè)定原理:
H2O2在240nm下有特征吸收峰,CAT能夠分解H2O2,使反應(yīng)溶液240nm下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降,根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出CAT活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
工作液:液體24mL×1瓶,4℃保存;
粗酶液提取:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至240nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 測(cè)定前將CAT檢測(cè)工作液在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。
3、 準(zhǔn)備96孔UV板一塊(非普通酶標(biāo)板,普通酶標(biāo)板只能透過可見光,不能透過紫外光,檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板)。
4、 在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和190μL工作液,混勻,記錄240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意事項(xiàng):出現(xiàn)負(fù)值怎么辦?
首先檢查吸光值是否超過3,如果超過3很可能是沒有用UV板,請(qǐng)換用UV板。如果未超過3,仍然出現(xiàn)負(fù)值則檢查反應(yīng)過程是否產(chǎn)生氣泡,氣泡多說明酶活性太高,氣泡影響產(chǎn)生了負(fù)值,可以將樣本用提取液稀釋10倍后再檢測(cè)。如果稀釋樣本或反應(yīng)體系沒有產(chǎn)生氣泡仍然出現(xiàn)較小的負(fù)值,說明該樣本測(cè)不到該酶活。
CAT活性計(jì)算:
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)CAT活力的計(jì)算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=459×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=459×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T =0.917×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:H2O2摩爾消光系數(shù),4.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。
b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)CAT活力的計(jì)算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=918×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=918×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=1.836×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:H2O2摩爾消光系數(shù),4.36×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。
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