酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonilyase,TAL)試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
TAL廣泛存在于植物和微生物中,是苯丙氨酸代謝途徑的關鍵酶之一。TAL能夠躍過肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)直接將酪氨酸轉化為香豆酸,香豆酸可進一步生成白藜蘆醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素類天然產物。
測定原理:
TAL能夠分解酪氨酸產生香豆酸,使反應溶液333nm下的吸光度隨反應時間而上升,根據吸光度的變化率可計算出TAL活性。
需自備的儀器和用品:
酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板(UV板)、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體50mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×2瓶,4℃保存;
試劑三:液體5mL×1瓶,4℃保存;
粗酶液提取:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)果汁等液體樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 酶標儀預熱30min以上,調節波長至333nm。
2、 準備96孔UV板一塊(非普通酶標板,普通酶標板只能透過可見光,不能透過紫外光,檢測波長小于340nm務必使用UV板)。
3、 試劑二的配置:臨用前在試劑二瓶中加入10mL試劑一充分溶解待用(用不完的試劑4℃保存一周,注意現配現用),在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。
4、在EP管中依次加入如下試劑
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本上清 | 40 | 40 |
試劑一 | 360 | |
試劑二 | 360 | |
充分混勻,40℃保溫60min | ||
試劑三 | 20 | 20 |
混勻,10000g 4℃離心5min,取200μL上清至96孔UV板,333nm下測定吸光值A測定與A對照,ΔA=A測定-A對照
TAL活性計算:
1、血清(漿)或果汁TAL活性
單位的定義:每分鐘每mL血清(漿)或果汁在每mL反應體系中使333nm處吸光值變化
0.005為一個酶活力單位。
TAL(U/mL)=ΔA×V反總÷( V樣÷V樣總)÷0.005÷T =35×ΔA
2、組織、細菌或細胞TAL活性
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個
酶活力單位。
TAL(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.005÷T =35×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個
酶活力單位。
TAL(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =35×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位定義:每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個酶活力單位。
TAL(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =0.07×ΔA
V反總:反應體系總體積,0.42mL;V樣:加入樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,60 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬。
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