羥自由基清除能力測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
羥自由基作用于體內蛋白質、核酸、脂類等生物分子,造成細胞結構和功能受損,進而導致體內代謝紊亂引起疾病。羥自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要指標之一,在抗氧化類保健品和藥品研究中得到廣泛應用。
測定原理:
H2O2/ Fe2+ 通過Fenton反應產生羥自由基,將鄰二氮菲- Fe2+水溶液中Fe2+氧化為Fe3+ ,導致536nm吸光度下降,樣品對536nm吸光度下降速率的抑制程度,反映了樣品清除羥自由基的能力。
自備實驗用品:
恒溫水浴鍋、酶標儀、96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100 mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體12mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體6mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑三:液體12 mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體6mL×1瓶,4℃保存。
樣品的制備:
1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 血清、果汁等液體樣品可直接測定。
3. 提取物(或者藥物)可配制成一定濃度,如5 mg/mL。
操作步驟:
1、 酶標儀預熱30min,調節波長至536nm。
2、 工作液配制:使用之前按照每管試劑一:試劑二:試劑三=100:50:100(µL)的比例配制,用多少配多少,混勻。
3、 在EP管中加入如下試劑
空白管 | 對照管 | 測定管 | |
工作液(µL) | 250 | 250 | 250 |
混勻,防止局部顏色過濃 | |||
樣品(µL) | 50 | ||
試劑四(µL) | 50 | 50 | |
H2O(µL) | 100 | 50 | |
混勻,37℃保溫60min,8000g 25℃離心5min,吸取200μL于96孔板中測定536nm處吸光值,空白管、對照管和測定管的吸光值分別記為A空、A對和A測。 |
注意:空白管和對照管只需測定一次。
計算公式:
羥自由基清除率 D% =(A測-A對)÷(A空-A對)×100%
A空、A對、A測:空白管、對照管和測定管的吸光值。
注意事項:
為了比較不同樣品羥自由基清除能力,對于同一批樣品必須加入等量的樣品,血清、組織勻漿、果汁等液體樣品加入同樣體積,提取物(或者藥物)配制成同樣濃度。
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