【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name :Duck Plague Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
鴨瘟,又稱鴨病毒性腸炎,是由皰疹病毒科鴨瘟病毒(Duck Plague Virus, DPV) 引起的一種急性(有時(shí)呈慢性)鴨、鵝和天鵝接觸性傳染病。其特征為體溫升高,兩腿麻痹,下痢,流淚和部分病鴨頭頸腫大。食道粘膜有小出血點(diǎn),并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍,泄殖腔粘膜充血出血水腫和假膜覆蓋。肝有不規(guī)則大小不等的出血點(diǎn)和壞死灶[1]。本病傳播迅速,發(fā)病率和死亡率高,嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展。
本試劑盒適用于檢測病鴨血液、口腔偽膜及潰瘍處粘液、肝、脾、腎等組織樣品 等樣本中的鴨瘟病毒,用于鴨瘟病毒感染的輔助診斷。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒對鴨瘟病毒基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針[1-3],用熒光 PCR 技術(shù)對鴨瘟病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名稱規(guī)格
酶液50μL×1 管
DPV 反應(yīng)液500μL×2 管
DPV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
注:
1)不同批號試劑不能混用。
2)試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列
熒光定量 PCR 檢測儀。
【標(biāo)本采集】
在發(fā)病早期,無菌采集病鴨血液或刮取口腔偽膜及潰瘍處粘液;在動(dòng)物死亡后,
無菌采取肝、脾、腎等組織樣品
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個(gè)月,標(biāo)本
運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
組織樣品:每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;粘液直接取 100μL 提取
1.2DNA 提取
推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒(離心柱提取
法),請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑DPV 反應(yīng)液酶液
用量(樣本數(shù)為 N)20μL1μL
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。
3.加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye) NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;
可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38, 且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
7.檢測方法的局限性
?樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
?樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
?陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果;
?病原體在流行過程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
?不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
?試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定 量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;
?本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項(xiàng)】
?所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;
?試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完-全混勻并短暫離心;
?反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
?反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
?使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
?樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
?實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;
?試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通 則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T-2744-2010 鴨病毒性腸炎檢疫技術(shù)規(guī)范[S]. 北京: 科學(xué)出版社, 2010.
[2]索化夷, 湯承, 岳華, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-PCR 檢測鴨瘟病毒方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2006.
[3]馬騰飛. 鴨瘟病毒熒光定量 PCR 檢測方法的建立及其強(qiáng)弱毒株 UL2 基因差異分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.
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