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禽腺病毒(FADV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)說明書

閱讀:294      發布時間:2024-10-14
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禽腺病毒(FADV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

 

通用名稱:禽腺病毒(FADV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法) 

Name :Fowl Adenovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

禽腺病毒(Fowl Adenovirus, FADV)是無囊膜、線性雙股 DNA 病毒,屬于腺病毒科、禽腺病毒屬成員。該病毒可感染雞、火雞及其他禽類。FADV 可致雞發生包涵體肝炎、心包積水綜合征和肌胃糜爛等疾病。該病常與禽類其他病原混合感染,感染雞只可繼發再生障礙性貧血、肝炎及產蛋量下降等。FADV 呈世界性分布,病毒可經糞-口途徑水平傳播,也可垂直傳播,給養禽業造成巨大經濟損失。

本試劑盒適用于檢測呼吸道分泌物棉拭子(感染 I 群禽腺病毒的雞、火雞、鵝、鵪鶉)、卵巢、輸卵管、卵泡、子宮和輸卵管粘膜組織、泄殖腔拭子(感染 II、III 群禽腺病毒的雞、鴨)等樣本中的禽腺病毒,用于禽腺病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術,設計一對禽腺病毒特異性引物,結合一條特異性探針[1], 用熒光 PCR 技術對禽腺病毒的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規格25T/盒50T/盒

FADV 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

FADV 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死禽取卵巢、輸卵管、卵泡、子宮和輸卵管粘膜組織;活雞取呼吸道拭子或泄殖腔拭子,放于 1mL 50%

甘油生理鹽水中

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區)

1.1樣本前處理

組織樣品:稱取樣品約 1g,手術剪剪碎混勻后,于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;泄殖腔拭子直接取 100μL 提取

1.2核酸提取

推薦采用優利科(上海)生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取,請    按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制(試劑準備區)

根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:

試劑FADV 反應液酶液

用量(樣本數為 N)20μL1μL

3.加樣(樣本處理區)

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.PCR 擴增(核酸擴增區)

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;

4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環參數設置:

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃10min

240 cycles94℃15sec

55℃30sec

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現整體傾斜時,根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。

5.2結果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數增長曲線;

可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長曲線, 判定為陽性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.質控標準

陰性質控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;

陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;

3.陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;

7.本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行;

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,完-全混勻并短暫離心;

3.反應液應避光保存;

4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]文艷玲, 禽腺病毒 hexon 基因克隆表達及間接 ELISA 和熒光 PCR 檢測方法的建立[J]. 廣西大學, 2008.

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優利科(上海)生命科學有限公司

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